Auswirkungen von molekularem Wasserstoff anhand eines Tiermodells und einer randomisierten klinischen Studie auf eine leichte kognitive Beeinträchtigung

Abstrakt

Hintergrund:

Oxidativer Stress ist einer der ursächlichen Faktoren bei der Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI) und Demenz. Wir haben zuvor berichtet, dass molekularer Wasserstoff (H2) als therapeutisches und vorbeugendes Antioxidans wirkt.

Zielsetzung:

Wir untersuchen die Auswirkungen des Trinkens von H2-Wasser (mit H2 infundiertes Wasser/ Wasserstoffwasser ) auf Mäuse und Probanden mit oxidativem Stress und MCI.

Methoden:

Transgene Mäuse, die eine dominant negative Form der Aldehyddehydrogenase 2 exprimierten, wurden als Demenzmodell verwendet. Den Mäusen mit erhöhtem oxidativem Stress wurde erlaubt, H2-Wasserstoffwasser zu trinken. In einer placebokontrollierten Doppelblindstudie mit Ran-Doming tranken 73 Probanden mit MCI ~ 300 ml H2-Wasserstoffwasser (H2-Gruppe) oder Placebo-Wasser (Kontrollgruppe) pro Tag und die kognitive Teilskala der Alzheimer-Krankheitsprüfung (ADAS-cog) Scores wurden nach 1 Jahr ermittelt.

Ergebnisse:

Bei Mäusen verringerte das Trinken von H2-Wasserstoffwasser die Marker für oxidativen Stress und unterdrückte den Rückgang von Gedächtnisstörungen und Neurodegeneration. Darüber hinaus war die mittlere Lebensdauer in der H2-Wasserstoffwasser -Gruppe länger als die der Kontrollgruppe. Obwohl bei MCI-Probanden nach 1 Jahr kein signifikanter Unterschied zwischen der Wasserstoffwasser  H2- und der Kontrollgruppe im ADAS-cog-Score bestand, verbesserten sich die Träger des Apolipoprotein E4 (APOE4) -Genotyps in der Wasserstoffwasser  H2-Gruppe signifikant im gesamten ADAS-cog Score und Word Recall Task Score (einer der Subscores im ADAS-Cog Score).

Fazit:

H2-Wasserstoffwasser kann in einem oxidativen Stressmodell und in den APOE4-Trägern mit MCI ein Potenzial zur Unterdrückung von Demenz aufweisen.

1. EINLEITUNG

Oxidativer Stress ist einer der ursächlichen Faktoren bei der Pathogenese der wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI) und Parkinson-Krankheit (PD) [ 1 , 2 ]. Darüber hinaus stellt der Genotyp von Apolipoprotein E4 (APOE4) ein genetisches Risiko für AD dar, und der erhöhte oxidative Stress in den APOE4-Trägern wird als einer der Modifikatoren für das Risiko angesehen [ 3 ].

Um wirksame Antioxidantien aus der Nahrung zu erforschen, um die altersabhängige Neurodegeneration zu mildern, kann es nützlich sein, Modellmäuse zu konstruieren, bei denen AD-Phänotypen in Abhängigkeit vom Alter als Reaktion auf oxidativen Stress fortschreiten würden. Wir konstruierten transgene DAL101-Mäuse, die einen Polymorphismus des mitochondrialen Aldehyddehydrogenase 2-Gens (ALDH2 * 2) exprimieren [ 4 ]. ALDH2 * 2 ist für einen Mangel an ALDH2-Aktivität verantwortlich und ist spezifisch für Nordost-Asiaten [ 5 ]. Wir haben zuvor berichtet, dass der ALDH2-Mangel ein Risikofaktor für spät auftretende AD in der japanischen Bevölkerung ist [ 6 ], der durch chinesische und koreanische Studien in ihrer jeweiligen Population reproduziert wurde [ 7 , 8 ]. DAL101-Mäuse zeigten eine verringerte Fähigkeit zur Entgiftung von 4-Hydroxy-2-nonenal (4-HNE) in kortikalen Neuronen und folglich eine altersabhängige Neurodegeneration, einen kognitiven Rückgang und eine verkürzte Lebensdauer [ 4 ].

Wir schlugen vor, dass molekularer Wasserstoff (H 2 ) ein Potenzial als neuartiges Antioxidans besitzt [ 9 ], und zahlreiche Studien deuteten nachdrücklich auf sein Potenzial für präventive und therapeutische Anwendungen hin [ 10 – 12 ]. Neben umfangreichen Tierversuchen wurden mehr als 25 klinische Studien zur Untersuchung der Wirksamkeit von H 2 durchgeführt , [ 11 , 12 ] einschließlich doppelblinder klinischer Studien. Basierend auf diesen Studien wächst das Gebiet der Wasserstoffmedizin rasant.

Es gibt verschiedene Methoden, um H 2 zu verabreichen, darunter das Einatmen von Wasserstoffgas (H 2 -Gas), das Trinken von H 2 -gelöstem Wasser (H 2 -Wasser) und das Injizieren von H 2 -gelöster Kochsalzlösung (wasserstoffreiche Kochsalzlösung) [ 13 ]. Das Trinken von H 2 -Wasser verhinderte die durch chronischen Stress verursachten Beeinträchtigungen des Lernens und Gedächtnisses, indem es den oxidativen Stress bei Mäusen reduzierte [ 14 ] und Nervenzellen durch Stimulierung der hormonellen Expression von Ghrelin schützte [ 15 ]. Darüber hinaus verbesserte die Injektion von wasserstoffreicher Kochsalzlösung die Gedächtnisfunktion in einem Rattenmodell für Amyloid-β-induzierte Demenz durch Reduktion von oxidativem Stress [ 16 ]. Darüber hinaus verbesserte die Inhalation von Wasserstoff während der normoxischen Wiederbelebung das neurologische Ergebnis in einem Rattenmodell des Herzstillstands unabhängig von einem gezielten Temperaturmanagement [ 17 ].

In dieser Studie untersuchten wir, ob das Trinken von H 2 -Wasser die durch oxidativen Stress bei DAL101-Mäusen verursachte altersabhängige Gedächtnisstörung unterdrücken kann. Als nächstes untersuchten wir in einer randomisierten, placebokontrollierten Doppelblindstudie, ob H 2 -Wasser das Fortschreiten des MCI verzögern kann, wie anhand der Scores auf der Subskala der Alzheimer Disease Assessment Scale-Cognition (ADAS-Cog) [ 18 , 19 ] vom Ausgangswert nach 1 Jahr. Wir fanden eine signifikante Verbesserung der Kognition nach 1 Jahr bei Trägern mit dem APOE4-Genotyp in der H 2 -Gruppe unter Verwendung von Sub- und Gesamt-ADAS-Cog-Scores.

2. MATERIALIEN UND METHODEN

2.1. Ethische Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme

Diese Tierstudie wurde vom Animal Care and Use Committee der Nippon Medical School genehmigt. Die Methoden wurden in „Übereinstimmung“ mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Das Protokoll der klinischen Studie wurde von den Ethikkommissionen der Universität Tsukuba genehmigt und am 17. Juli 2009 im medizinischen Informationsnetz der Universitätsklinik (UMIN) unter der Nummer UMIN000002218 unter https://upload.umin.ac.jp/cgi-open registriert -bin / ctr / ctr.cgi? function = history & action = list & type = summary & recptno = R000002-725 & language = J.

Die Teilnehmer wurden ab Juli 2009 eingeschrieben. Alle Patienten gaben vor den Forschungsuntersuchungen, die gemäß der Deklaration von Helsinki und den nachfolgenden Revisionen durchgeführt wurden, eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

2.2. Transgene DAL101-Mäuse

Transgene Mäuse (DAL101), die ein Transgen exprimieren, das eine Mausversion von ALDH2 * 2 enthält, wurden wie zuvor beschrieben konstruiert [ 4 ]. Da die Anzahl der für jedes Experiment verwendeten Mäuse aufgrund einer Zuchtschwierigkeit nicht konsistent war, wurde die Anzahl der verwendeten Mäuse angegeben. Alle Mäuse wurden in einem 12-stündigen Hell / Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Prüfer führten die Versuche blind durch. Da bei Wildtyp-Mäusen mit dem gleichen genetischen Hintergrund (C57BL / 6) im Alter von 18 Monaten keine signifikante Abnahme der kognitiven Beeinträchtigung beobachtet wurde [ 4 ], wurden die Auswirkungen von H 2 -Wasser in dieser Studie nicht bewertet.

2.3. Wasserstoff Wasser

Für Tierversuche wurde gesättigtes H 2 -Wasser wie zuvor beschrieben hergestellt [ 14 ]. Kurz gesagt wurde H 2 in Wasser unter hohem Druck (0,4 MPa) bis zu einem übersättigten Niveau gelöst, und das gesättigte H 2 -Wasser wurde unter atmosphärischem Druck in einem Aluminiumbeutel ohne Kopfraum gelagert. Als Kontrolle wurde H 2 -Wasser durch leichtes Rühren für einen Tag vollständig entgast. Mäusen wurde Wasser in geschlossenen Glasgefäßen, die mit einer Auslassleitung mit zwei Kugellagern ausgestattet waren, frei gegeben, um die Entgasung des Wassers zu verhindern. Das Gefäß wurde 6 Tage die Woche um 14:00 Uhr frisch mit H 2 -Wasser aufgefüllt. Die H 2 -Konzentration betrug am nächsten Tag noch mehr als 0,3 mM.

Für diese klinische Studie war im Handel erhältliches H 2 -Wasser ein Geschenk von Blue Mercury, Inc. (Tokio, Japan). Das H 2 -Wasser (500 ml) wurde in einen Aluminiumbeutel ohne Kopfraum gepackt, um die H 2 -Konzentration aufrechtzuerhalten, und 30 Minuten bei 80 ° C sterilisiert. Die Konzentration von H 2 wurde unter Verwendung eines Wasserstoffsensors (Unisense, Aarhus N, Dänemark) gemessen und verwendet, wenn der Wert mehr als 0,6 mM betrug. Placebo-Wasser in einer identischen Packung (500 ml) wurde ebenfalls von Blue Mercury Inc. bereitgestellt. Dieses Unternehmen spielte keine Rolle bei der Datenerfassung, -verwaltung, -analyse oder -interpretation. Eine Packung mit 500 ml Placebo oder H 2 -Wasserstoffwasser pro Tag wurde bereitgestellt, nachdem zuvor leere Packungen gezeigt worden waren, anhand derer die selbst berichteten Compliance-Raten in der Interventionsgruppe als das Volumen von H 2 -Wasserstoffwasser nach einem Jahr berechnet wurden.

2.4. Messung von oxidativem Stress

Als Marker für oxidativen Stress wurde 8-OHdG [ 20 ] unter Verwendung von Urinproben gemessen, die zwischen 9:00 und 10:00 Uhr, wie zuvor beschrieben [ 21 ], unter Verwendung eines kompetitiven enzymgebundenen Immunoassays (New 8-OHdG) gesammelt wurden Scheck; Japanisches Institut zur Kontrolle des Alterns, Shizuoka, Japan). Die Werte wurden durch die Kreatininkonzentration im Urin normalisiert, die unter Verwendung eines Standardkits (Wako, Kyoto, Japan) getestet wurde. Als zusätzlicher Marker für oxidativen Stress im Gehirn wurde akkumuliertes MDA unter Verwendung eines Bioxytech MDA-586-Assay-Kits (Percipio Biosciences, CA, USA) bestimmt. Malondialdehyd (MDA) -Werte wurden gegen Proteinkonzentrationen normalisiert.

2.5. Messung von Gedächtnisstörungen: Objekterkennungsaufgabe

Lern- und Gedächtnisfähigkeiten wurden mit der Einspruchserkennungsaufgabe (ORT) untersucht [ 4 ].Eine Maus wurde 4 Stunden in einem Käfig gehalten, und dann wurden der Maus zwei unterschiedlich geformte Objekte für 10 Minuten als Training präsentiert. Die Häufigkeit, mit der jedes Objekt erkundet und / oder beschnüffelt wurde, wurde für die ersten 5 Minuten gezählt (Trainingstest). Die Frequenzen (%) im Trainingstest wurden als Hintergrund betrachtet. Um die Gedächtnisretention nach 1 Tag zu testen, wurde eines der ursprünglichen Objekte durch ein neues Objekt mit einer anderen Form ersetzt, und dann wurden die ersten 5 Minuten der Exploration und / oder des Schnüffelns gezählt (Retentionstest). Wenn Mäuse ihre Lern ​​- und Gedächtnisfähigkeiten verlieren, sollten die Erkundungs ​​- und / oder Schnüffelfrequenzen der einzelnen Objekte in der Trainingseinheit gleich sein (etwa 50%), was darauf hinweist, dass Mäuse aufgrund fehlenden Gedächtnisses für die Objekte ein ähnliches Interesse zeigten Objekte. Lern- und Gedächtnisfähigkeiten wurden als Subtraktion der Frequenzen (%) im Retentionstest von jedem Hintergrund bewertet (Trainingstest).

2.6. Messung von Gedächtnisstörungen: Passive Vermeidungsaufgabe (PA)

Die Apparatur bestand aus zwei Fächern, einem hellen und einem dunklen, die durch eine vertikale Schiebetür voneinander getrennt waren [ 22 ]. Am ersten Tag haben wir zunächst eine Maus für 20 s in das Lichtfach gelegt. Nachdem die Tür geöffnet wurde, konnte die Maus das dunkle Fach betreten (Mäuse ziehen es instinktiv vor, im Dunkeln zu sein). Am Tag 2 wurde die Maus erneut in den hellen Bereich gebracht, damit sich die Maus in den dunklen Bereich bewegen konnte. Nachdem die Maus das dunkle Abteil betreten hatte, wurde die Tür geschlossen. Nach 20 s erhielt die Maus 2 s lang einen Stromschlag von 0,3 mA. Die Maus konnte sich 10 s lang erholen und wurde dann in den Heimkäfig zurückgebracht.Am Tag 3, 24 Stunden nach dem Schock, wurde die Maus erneut in den hellen Bereich gebracht, wobei die Tür geöffnet war, damit sich die Maus in den dunklen Bereich bewegen konnte. Wir untersuchten die Latenzzeit, um durch die Tür zu treten. Lern- und Gedächtnisfähigkeiten wurden als Subtraktion der Latenzzeiten nach dem Stromschlag von jedem Hintergrund (vorher) bewertet.

2.7. Immunfärbung der Hippocampus-CA1-Region

Um den neuronalen Verlust und die Gliaaktivierung zu untersuchen, wurde die Hippocampusregion mit einem pyramidalen neuronenspezifischen Anti-NeuN-Antikörper (Klon A60; Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland), einem Astrozyten-spezifischen Anti-Glia-Fibrillen-Säureprotein (Anti-GFAP), angefärbt. Antikörper (Thermo Scientific, MA, USA) oder ein Mikroglia-spezifischer Anti-IbaI-Antikörper (Wako).Die Mäuse wurden transkardial perfundiert, um mit 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Narkose fixiert zu werden, und ihre Gehirne wurden mit 30% Saccharose kryoprotektiert, und dann wurde das gefrorene Gehirn bei einer Dicke von 8 & mgr; m geschnitten. Nach der Inkubation mit jedem Primärantikörper wurden die Schnitte mit Sekundärantikörpern (Vector Laboratories, CA, USA) behandelt und ihre Immunreaktivität durch die Avidin-Biotin-Komplex-Methode (Vector Laboratories) sichtbar gemacht.

2.8. Themen der klinischen Studie

Diese Studie war eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Studie, die im Rahmen des Tone-Projekts durchgeführt wurde, einer laufenden epidemiologischen Studie in Tone Town, Ibaraki, Japan, wie zuvor ausführlich beschrieben [ 23 , 24 ]. Diese Stadt liegt ca. 40 km nordöstlich von Tokio und besteht aus 22 Stadtteilen. An der Grunderhebung des Tone-Projekts nahmen im Juli 2009 1.032 Teilnehmer teil. Aus diesen Teilnehmern wurden die Probanden der vorliegenden Studie rekrutiert.

Zulassungskriterien sind das Alter von 67 Jahren oder älter, die schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der vorliegenden Studie mit der Diagnose MCI und die Einhaltung der folgenden Anforderungen: gute Einhaltung des Wasserverbrauchs; Teilnahme an den geplanten Prüfungen zur Begutachtung; Führen eines Tagebuchs zum Aufzeichnen des Wasserverbrauchs mit einem modifizierten Hachinski Ischemic Score von 4 oder weniger und einem Geriatric Depression Scale Score von 6 oder weniger von 15 Punkten. Kurz gesagt, 3 Monate vor dieser klinischen Studie wurden alle Teilnehmer einer Gruppenbewertung unterzogen, bei der ein Satz von 5 Tests verwendet wurde, mit denen die folgenden kognitiven Bereiche gemessen wurden: Aufmerksamkeit; Erinnerung; visuospatiale Funktion; Sprache; und Argumentation wie zuvor beschrieben [ 25 ]. Objektive Beeinträchtigung in mindestens einer kognitiven Domäne basierend auf dem Durchschnitt der Bewertungen der neuropsychologischen Maßnahmen in dieser Domäne und 1 SD-Cut-Off unter Verwendung normativer Korrekturen für Alter, Bildungsjahr und Geschlecht.

Ausschlusskriterien waren das „Diagnostische und Statistische Handbuch für psychische Störungen (DSM) – IV TR“ -Kriterium für Demenzkrankheiten, schwerwiegende oder instabile Krankheiten, eine Vorgeschichte von schwerwiegenden Infektionskrankheiten, die das Gehirn betreffen, und / oder bösartige Krankheiten in den letzten 5 Jahren eine Vorgeschichte von Alkohol- oder Drogenmissbrauch oder -abhängigkeit (in Abhängigkeit von DSM-IV TR) innerhalb der letzten 5 Jahre und die Einnahme von allen Arten von Anti-Alzheimer-Medikamenten sowie die kürzliche Einnahme von Medikamenten (innerhalb von 4 Wochen), die das Zentralnervensystem betreffen. Wenn der Wert der Mini Mental State Examination (MMSE) [ 26 ] unter 24 lag, wurden die Probanden ausgeschlossen.

In dieser Studie wurden die Probanden nach dem Zufallsprinzip entweder einer Interventionsgruppe, die 1 Jahr lang täglich H 2 -wasserstoffWasser erhielt, oder einer Kontrollgruppe, die Placebo-Wasser erhielt, zugeordnet.Die Zuordnungsreihenfolge wurde durch computergenerierte Zufallszahlen bestimmt, die den Ermittlern und Probanden verborgen blieben. Drs. Nakajima und Ikejima generierten die zufällige Zuordnungssequenz, registrierten Teilnehmer und wiesen Teilnehmer Interventionen zu. Alle Teilnehmer und Leistungserbringer wurden blind maskiert.

Im ursprünglichen Protokoll planten wir, H 2 -wasserstoffWasser für 2 Jahre zu verabreichen und die sekundären Ergebnisse zu bewerten. Wir mussten das Projekt jedoch 2011 aufgrund der Tsunami-Katastrophe stoppen und konnten die 2-Jahres-Daten und sekundären Ergebnisse nicht erhalten.

Der APOE4-Genotyp wurde wie beschrieben bestimmt [ 25 ].

2.9. Statistische Überlegungen

Alle statistischen Analysen wurden von einem akademischen Biostatisten unter Verwendung der SAS-Softwareversion 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden bei p <0,05 als signifikant angesehen.

Für den Vergleich von zwei Gruppen in Bezug auf Lern- und Gedächtnisfähigkeit und Lebensdauer wurde der ungepaarte zweiseitige Student- t- Test zum Vergleich der H 2 -wasserstoff Wasser Gruppe mit der Kontrollgruppe verwendet. Für die anderen Tierversuche wurde, sofern nicht anders angegeben, eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-Kramer- oder Dunnett-Post-hoc-Analyse durchgeführt.

Für die klinische Studie planten wir die Rekrutierung von insgesamt 120 Patienten, die mit einer Leistung von 90% eine Effektgröße von 0,6 mithilfe eines zweiseitigen Tests mit einem Signifikanzniveau von 5%, jedoch der tatsächlichen Probengröße für die Primäranalyse, nachweisen sollten war 73, was zu 70% Leistung in der gleichen Einstellung führte. Die Endpunkte lauteten in der japanischen Version von ADAS-cog nach einem Jahr und die Änderungen wurden sowohl mit dem U-Test (nicht parametrische Analyse) von Mann-Whitney als auch mit dem t- Test (parametrische Analyse) von Student bewertet.

3. ERGEBNISSE

3.1. Wasserstoff-Wasser-reduzierter oxidativer Stress bei DAL-Mäusen

Männlichen DAL101-Mäusen wurde ab einem Alter von 1 Monat H 2 -wasserstoffWasser  oder Kontrollwasser ad libitumverabreicht, das bis zum Alter von 18 Monaten fortgesetzt wurde. Die H 2 -wasserstoffWasser-DAL101-Gruppe zeigte im Alter von 14 Monaten eine signifikante Abnahme des Spiegels eines oxidativen Stressmarkers, 8-Hydroxy-2′-desoxyguanosin (8-OHdG) [ 20 ], im Urin (Suppl. Abb. S1A ). Darüber hinaus erhöhten DAL101-Mäuse den oxidativen Stress im Gehirn, gemessen anhand des Spiegels von MDA als alternativem Marker für oxidativen Stress, und H 2 -wasserstoffWasser zeigte eine signifikante Erholung dieses erhöhten Spiegels von MDA in DAL101-Mäusen (Suppl. Abb. S1B ).

3.2. Wasserstoffwasser unterdrückte einen Rückgang der Lern- und Gedächtnisstörungen

Wir untersuchten Lern- und Gedächtnisfähigkeiten mit ORT [ 4 ]. Wie in MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben , wurden Lern- und Gedächtnisfähigkeiten als Subtraktion der Häufigkeit (%) im Retentionstest von jedem Hintergrund bewertet (Trainingstest). Die Mäuse wurden ab dem Alter von 1 Monat mit Kontroll- oder H 2 -wasserstoffWasser versorgt. Im Alter von 14 Monaten erinnerte sich die H 2 -wasserstoffWasser Gruppe signifikant an die ursprünglichen Objekte und zeigte die Präferenz für das neue Objekt gegenüber der Kontrollgruppe ( 1A – 14 Monate alt ).

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Wasserstoffwasser verhinderte den kognitiven Verfall. 2 -wasserstoffWasser  wurde ab dem Alter von 1 Monat ( A, C) und ab dem Alter von 8 Monaten ( B ) bereitgestellt. Die Mäuse wurden im Alter von 14 Monaten ( A, B, 14 Monate alt ) der ersten Einspruchserkennungsaufgabe (ORT) und im Alter von 18 Monaten ( A, B, 18 Monate alt ) der zweiten ORT unterzogen ). Die Erkennungsindizes wurden als die Häufigkeit (%) des Erforschens und / oder Schnüffelns des zu ersetzenden Objekts oder des zu ersetzenden neuen Objekts erhalten. ΔRecognition Index (%) gibt die Häufigkeiten im Retentionstest der ORT nach Abzug derjenigen im Trainingstest (Hintergrund) an. WT, Wildtyp; (DAL, H 2 -), DAL101-Mäuse, die entgastes Kontrollwasser trinken; (DAL, H 2 +), DAL101-Mäuse, die Wasserstoffwasser trinken. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. n = 9, * p <0,05, ** p <0,01 nach Student’s t- Test. C ) Die Mäuse wurden einer passiven Ausweichaufgabe unterzogen. Durchgangswartezeiten vor und nach dem Stromschlag werden erhalten, und & Dgr; Durchgangswartezeit (en) gibt die Subtraktion der Durchgangswartezeiten nach von vor dem Stromschlag an.WT, Wildtyp (n = 10); DAL-, H 2 -, DAL101-Mäuse, die entgastes Kontrollwasser erhalten (n = 8); und DAL, H 2+, DAL101-Mäuse, die H 2 -wasserstoffWasser (n = 8) erhalten. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. p<0,05.

Im Alter von 18 Monaten wurden die Mäuse der zweiten ORT unterzogen, die mit 18 Monaten unter Verwendung verschiedener Objekte durchgeführt werden kann [ 14 ]. Die gealterten DAL101-Mäuse, die H 2 -wasserstoffWasser tranken, erinnerten sich noch signifikant an die ursprünglichen Objekte und zogen das neue der Kontrollgruppe vor ( 1A – 18 Monate alt ).

Um die Trinkwirkung von H 2 -wasserstoffWasser im späteren Stadium zu testen, begannen wir mit der Gabe von H 2-wasserstoffWasser an männliche DAL101-Mäuse im Alter von 8 Monaten anstelle von 1 Monat und wurden im Alter von 14 Monaten einer ORT unterzogen ( Abb. 1B 1B 14 Monate alt ) und die zweite ORT im Alter von 18 Monaten (Abb. 1B 1B 18 Monate alt ). Selbst wenn die Mäuse im Alter von 8 Monaten zu trinken begannen, unterdrückte H 2 -wasserstoffWasser den Rückgang der Lern- und Gedächtnisfähigkeit im Alter von 18 Monaten sowie im Alter von 14 Monaten signifikant ( 1B, 1B ). .

Als alternative Methode haben wir die Mäuse im Alter von 18 Monaten mit PA [ 22 ] behandelt. Einen Tag nach einem Stromschlag von 0,3 mA für 2 s wurde bei Wildtyp-C57BL / 6-Mäusen der Schock gespeichert, der durch Subtraktion der Latenzzeit (en) zum Wiedereintritt in das dunkle Kompartiment von jedem Hintergrund aus bewertet wurde (Fig. 1C1C ). Die H 2 -Wassergruppe unterdrückte den Lern- und Gedächtnisrückgang signifikant stärker als die Kontrollgruppe ( 1C 1C ).

Somit unterdrückte das Trinken von H 2 -wasserstoffWasser die Lern- und Gedächtnisstörung bei Mäusen mit oxidativem Stress.

3.3. Wasserstoff-Wasser-supprimierte Neurodegeneration

Um zu untersuchen, ob H 2 -wasserstoffWasser die Neurodegeneration in gealterten DAL101-Mäusen verhindern kann, färbten wir den Hippocampus mit einem neuronenspezifischen Anti-NeuN-Antikörper ( 2A – 2A ).Die Neurodegeneration wurde durch Gliaaktivierung unter Verwendung eines Anti-GFAP-Antikörpers und eines Mikroglia-spezifischen Anti-Iba-I-Antikörpers bewertet. Immunpositive Zellen pro Sichtfeld (FOV) wurden in der CA1-Region gezählt ( 2B, 2B ).

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Wasserstoffwasser unterdrückte die Neurodegeneration. A ) Die Hippocampus-CA1-Region wurde mit Antikörpern gegen NeuN (ein neuronaler Marker), GFAP (ein Astrozyten-Marker) oder Iba-1 (ein Mikroglia-Marker) angefärbt (Maßstäbe: 50 um). Die rechten Felder zeigen vergrößerte Bilder der Quadrate in den linken Feldern (Maßstabsbalken: 10 µm). B ) Zellen, die positiv auf Anti-NeuN-, Anti-GFAP- und Anti-Iba-I-Antikörper pro Sichtfeld (FOV) waren, wurden in der CA1-Region gezählt (n = 5). Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben. p <0,05, ** p <0,01 (Wildtyp gegen DAL), # p <0,05 (H 2 -wasserstoffWasser gegen Kontrollwasser in DAL).

Die Anzahl der Neuronen war in der Kontroll-DAL101-Gruppe im Vergleich zur Wildtyp-Gruppe verringert, und die H 2 -DAL101-Gruppe zeigte einen Trend zur Erholung der Abnahme ( 2A – 2A ). Wie zuvor beschrieben, [ 4 ] zeigten die Kontroll-DAL101-Mäuse einen Anstieg der Glia-Aktivierung, und die H 2 -wasserstoffWasser-Gruppe unterdrückte die verstärkte Glia-Aktivierung in der CA1-Region ( 2 2 , GFAP und Iba-I).

3.4. Wasserstoff-Wasser verlängerte die durchschnittliche Lebensdauer von Mäusen

DAL101-Mäuse zeigten eine kürzere Lebensdauer, wie bereits beschrieben [ 4 ]. Um zu untersuchen, ob der Verbrauch von H 2 -wasserstoffWasser die verkürzte Lebensdauer verkürzte, begannen weibliche DAL101-Mäuse im Alter von 1 Monat, Kontroll- oder H 2 -Wasser zu trinken. Obwohl H 2 -wasserstoffWasser die maximale Lebensdauer nicht verlängerte ( 3A – 3A ), verlängerte H 2 -wasserstoffWasser die durchschnittliche Lebensdauer von DAL101-Mäusen signifikant ( 3B – 3B ).

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Verlängerung der durchschnittlichen Lebensdauer durch kontinuierliches Trinken von H 2 -wasserstoffWasser. A) Kaplan-Meier-Kurve, die das Überleben von weiblichen C57BL / 6-Mäusen (Wildtyp), weiblichen DAL101-Mäusen, die Kontrollwasser (Kontrollwasser) und H 2 -wasserstoffWasser trinken, darstellt. B ) Jeder Punkt gibt die Lebensdauer jeder Maus an. Die Balken geben die durchschnittliche Lebensdauer jeder Gruppe an. p < 0,05 (p = 0,036) nach Student’s t- Test.

3.5. Eine randomisierte, placebokontrollierte klinische Studie

shows the profile on the recruitment, randomization, and follow-up of this study. Abb. (4 4 ) zeigt das Profil der Rekrutierung, Randomisierung und Nachverfolgung dieser Studie. Insgesamt 81 Probanden der 1.032 Teilnehmer wurden randomisiert; 3 in der Kontrollgruppe und 5 in der Interventionsgruppe wurden jedoch nach Randomisierung als nicht förderfähig diagnostiziert und nicht in diese Analyse einbezogen.Die Ausgangsmerkmale und Lebensstilfaktoren waren zwischen den Studiengruppen ausgewogen (Tabelle 11 ). Die zufällige Zuordnung wurde nach Alter von ~ 74 Jahren und MMSE-Punktzahl von ~ 28 Punkten geschichtet. Die durchschnittliche Compliance-Rate von Trinkwasser wurde in beiden Gruppen nach einem Jahr auf 64% geschätzt, was bedeutet, dass die Probanden durchschnittlich 320 ml / Tag tranken. Die mittleren Gesamt-ADAS-cog-Scores in den H 2 wasserstoffWasser – und Kontrollgruppen betrugen 8,04 bzw. 7,89, ohne dass eine Signifikanz bestand.

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Profil der Rekrutierung, Randomisierung und Nachverfolgung dieser Studie. Diese Studie war eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Studie, die im Rahmen des Tone-Projekts durchgeführt wurde, einer laufenden epidemiologischen Studie in Tone Town, Ibaraki, Japan [ 23 , 24 ].

Tabelle 1

Hintergrundmerkmale von 73 Probanden mit leichter kognitiver Beeinträchtigung.

Kontrolle (n = 38) Intervention (n = 35)
Bedeuten SD oder% Bedeuten SD oder%
Frau * 20 (52,6%) 19 (54,3%)
Alter Jahre) 74,45 5,44 73,97 5.11
Body Mass Index (kg / m 2 ) 23,55 2.59 23,19 4,08
Systolischer Blutdruck (mmHg) 131,26 12,35 135,14 13.31
Diastolischer Blutdruck (mmHg) 77,92 7.13 78,89 9,53
Ausbildung (Jahre) 11.26 2,71 11,57 2,83
Aktueller Alkoholtrinker * 19 (50,0%) 14 (40,0%)
Derzeitiger Raucher * 4 (10,5%) 5 (14,3%)
Aktuelle Trainingsgewohnheit * 27 (71,1%) 22 (62,9%)
APOE4-Träger * 6 (15,7%) 7 (20,0%)
Familiengeschichte * 2 (5,3%) 2 (5,7%)
Komorbidität *
Hypertonie fünfzehn (39,5%) 14 (40,0%)
Diabetes Mellitus 4 (10,5%) 5 (14,3%)
Dyslipidämie 4 (10,5%) 4 (11,4%)
Schlaganfall 2 (5,3%) 1 (2,9%)
Depression 1 (2,6%) 2 (5,7%)
MMSE 28.08 1,66 27,83 1,74
ADAS-Zahnrad 7,89 3.19 8.04 3,47

* gibt die Häufigkeit (%) an.

Nach 1 Jahr wurden in jeder Gruppe keine beobachtbaren Schäden oder unbeabsichtigten Wirkungen festgestellt, und es gab einen Trend zur Verbesserung des gesamten ADA-Zahn-Scores sowohl in der H 2 – als auch in der Kontrollgruppe (Suppl. Tabelle S1 ), wahrscheinlich aufgrund von Interventionen wie z als mäßige Übung vom Tone-Projekt. Darüber hinaus zeigten die Probanden in der H 2 -wasserstoffWasser Gruppe mehr Tendenzen zur Verbesserung als diejenigen in den Kontrollgruppen, obwohl keine Signifikanz bestand (Suppl. Tabelle S1 ). Wenn wir jedoch auf Änderungen der Punktzahl bei Trägern des APOE4-Genotyps achten, verbessern sich die Gesamtpunktzahlen für ADAS-Zahnräder und Wortrückrufaufgaben (eine der Teilpunktzahlen) signifikant, wie durch die Verteilung der Punktzahländerungen in jedem Subjekt beurteilt ( Fig. 5 5 ). Bei den APOE4-Trägern verbesserte sich die wasserstoffWasser H 2 -Gruppe signifikant, während sich die Kontrollgruppe leicht verschlechterte. shows the score change of each subject as an alternative presentation. Darüber hinaus zeigt 6 ( 6 ) die Punktzahländerung jedes Subjekts als alternative Darstellung.Obwohl sich die Probanden in der Kontrollgruppe nicht verbesserten, verbesserten sich sechs und fünf von sieben Probanden in der wasserstoffWasser H 2 -Gruppe der APOE4-Träger in der ADAS-Gesamtbewertung bzw. der Wortrückruf-Aufgabenbewertung.

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Verteilung der Änderungen des Sub- und Total-ADAS-Cog-Scores. Verteilung der Bewertung der Wortwechselaufgabe ( A ), einer Unterbewertung von ADAS-cog und ( B ) der gesamten ADAS-cogs-Bewertung in APOE4-Nicht-Carriern (links) und APOE4-Carriern (rechts). Jeder Punkt zeigt den Wechsel der einzelnen Themen an. Der Unterschied zwischen der H2- und der Kontrollgruppe war bei APOE4-Trägern sowohl durch eine nichtparametrische Analyse als auch durch eine parametrische Analyse signifikant. A ) p = 0,036 (nach Student’s t- Test) und p = 0,047 (nach Mann-Whitneys U-Test) und ( B ) p = 0,037 (nach Student’s t- Test) und p = 0,044 (nach Mann-Whitneys U-Test) ) für ( A ) bzw. ( B ). Mittlere Balken in Rauten geben Medianwerte an.

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Änderungen in einem Sub-Sore- und Gesamt-ADAS-Cog-Score für jedes Subjekt in den APOE4-Trägern. Jede Zeile gibt die Änderung der Wortrückruf-Aufgabenbewertung ( A ) und der Gesamt-ADAS-Zahnradbewertung ( B ) eines Probanden in den APOE4-Trägern um 1 Jahr an. * zeigt p <0,05 an, wie in der Legende von 5 gezeigt .

DISKUSSION

Altersabhängige neurodegenerative Erkrankungen sind an oxidativem Stress beteiligt. In dieser Studie haben wir das Trinken gezeigt

2 -wasserstoffWasser unterdrückte den biochemischen, verhaltensbezogenen und pathologischen Rückgang bei Mäusen mit oxidativem Stress. Der Score von ADAS-cog [ 18 ] ist das am häufigsten verwendete allgemeine kognitive Maß in klinischen Studien mit AD [ 27 , 28 ]. Der ADAS-Cog-Score bewertet mehrere kognitive Bereiche, einschließlich Gedächtnis, Sprache, Praxis und Orientierung. Insgesamt hat sich das ADAS-Zahnrad für seinen Verwendungszweck bewährt. Die vorliegende klinische Studie zeigt, dass das Trinken von H 2 -wasserstoffWasser den ADAS-cog-Score von APOE4-Genotypträgern signifikant verbessert.

Wir haben zuvor gezeigt, dass DAL101-Mäuse eine altersabhängige Neurodegeneration und einen kognitiven Rückgang sowie eine verkürzte Lebensdauer aufweisen [ 4 ]. DAL101-Mäuse zeigen altersabhängig Demenz-Phänotypen als Reaktion auf zunehmenden oxidativen Stress [ 4 ]. Oxidativer Stress verstärkt die Lipidperoxidation und führt zur Bildung hochreaktiver α, β-ungesättigter Aldehyde wie MDA und 4-HNE [ 29 ]. Die Anreicherung von 4-HNE-addukten Proteinen in pyramidalen Neuronen wurde im Gehirn von Patienten mit AD und PD beobachtet [ 30 ]. Der Rückgang der ALDH2 * 2-Fähigkeit konnte zytotoxische Aldehyde nicht entgiften und führte zu einem Anstieg des oxidativen Stresses [ 31 ].

Darüber hinaus wurden doppelt-transgene Mäuse durch Kreuzen von DAL101-Mäusen mit Tg2576-Mäusen konstruiert, die eine mutierte Form des humanen Amyloid-Vorläuferproteins (APP) exprimieren.Sie zeigten eine beschleunigte Amyloidablagerung, Tau-Phosphorylierung und Gliose sowie beeinträchtigte Lern- und Gedächtnisfähigkeiten. Die Lebensdauer von APP / DAL-Mäusen war signifikant kürzer als die von APP- und DAL101-Mäusen [ 32 ]. Daher können diese Modelltiere hilfreich sein, um Antioxidantien zu untersuchen, die in der Lage sein könnten, altersabhängige Demenz zu verhindern. In der Tat zeigte eine Diät, die Chlorella enthielt, geringere Auswirkungen auf den kognitiven Rückgang von DAL101 [ 33 ].

Einer der stärksten Risikofaktoren für AD ist der Trägerstatus des APOE4-Genotyps, und die Rolle von APOE4 für das Fortschreiten der AD wurde unter verschiedenen Gesichtspunkten eingehend untersucht [ 34 , 35 ]. APOE4 erhöht auch die Anzahl atherogener Lipoproteine ​​und beschleunigt die Atherogenese [ 36]. Der erhöhte oxidative Stress in APOE4-Trägern wird als einer der Modifikatoren für das Risiko angesehen [ 3 ]. Eine Kombination von Antioxidantien verbesserte die kognitive Funktion gealterter Probanden nach 3 Jahren, insbesondere bei APOE4-Trägern [ 23 ]. Dieses bisherige klinische Ergebnis stimmt mit der vorliegenden Studie überein. 2 wasserstoffWasser wirkt aufgrund seiner Fähigkeit, schnell über Membranen zu diffundieren, als wirksames Antioxidans in Zellen [ 9 ]. Darüber hinaus scheint wasserstoffWasser H 2 als sekundäre antioxidative Funktion den NF-E2-verwandten Faktor 2 (Nrf2) zu aktivieren [ 10 ], der den oxidativen Stress durch Expression einer Vielzahl von antioxidativen Enzymen reduziert [ 37 ]. Wir berichteten, dass das Trinken von wasserstoffWasser H 2 -Wasser die Arteriosklerose bei APOE-Knockout-Mäusen verhinderte, ein Modell für die spontane Entwicklung von Atherosklerose, die mit einer Abnahme des oxidativen Stresses einhergeht [ 38 ]. Daher ist es möglich, dass das Trinken von H 2 -wasserstoffWasser  die Schädigung der Gefäße verbessert, indem oxidativer Stress als direktes oder indirektes Antioxidans verringert wird, was zur Verbesserung eines Demintia-Modells und von MCI-Probanden führt. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf den Genotyp von APOE-Isoformen; Der Polymorphismus des APOE-Gens in der Promotorregion beeinflusst jedoch die Expression des APOE-Gens [ 39 ]. Daher ist es wichtig, die Wirkung von H 2 -wasserstoffWasser unter diesem Polymorphismus zu untersuchen.

Bei der Linderung der AD wurde besonderes Augenmerk auf regelmäßige, moderate körperliche Betätigung gelegt, um das Demenzrisiko zu senken und die Entstehung von MCI bei älteren Patienten zu verhindern [ 40 – 42 ]. Moderate Bewegung fördert den Energiestoffwechsel und unterdrückt die Expression entzündungsfördernder Zytokine [ 43 ] und schützt das Gefäßsystem [ 40 , 44 , 45 ]. 2 zeigt mehrere Funktionen durch eine Abnahme der Niveaus von entzündungsfördernden Zytokinen und eine Zunahme des Energiestoffwechsels zusätzlich zu den Antioxidationsfunktionen. Um mehrere Funktionen auszuüben, reguliert H 2 verschiedene Signalübertragungswege und die Expression vieler Gene [ 10 ].Beispielsweise schützt H 2 neuronale Zellen und stimuliert den Energiestoffwechsel, indem es die hormonelle Expression von Ghrelin [ 15 ] bzw. Fibroblastenwachstumsfaktor 21 [ 21 ] stimuliert. Im Gegensatz dazu lindert H 2 Entzündungen, indem es entzündungsfördernde Zytokine senkt [ 46 ]. Daher könnte die Kombination dieser H 2 -Funktionen bei Entzündungshemmung und Stimulierung des Energiestoffwechsels den Rückgang der Gehirnfunktion verhindern, [ 10 ] die beide durch regelmäßiges und mäßiges Training verbessert werden. Somit ist es möglich, dass die Mehrfachfunktionen von H 2 , einschließlich der Stimulierung des Energiestoffwechsels und der Entzündungshemmung, zur Verbesserung des Demenzmodells und der MCI-Probanden beitragen.

Als alternativer Aspekt unterdrückt H 2 den Kernfaktor des Transkriptionswegs aktivierter T-Zellen (NFAT), um verschiedene Genexpressionsmuster zu regulieren [ 47 ]. Die NFAT-Signalübertragung ist bei AD verändert und spielt eine wichtige Rolle beim Antrieb der Amyloid-β-vermittelten Neurodegeneration [ 48 ]. Darüber hinaus trägt die NFAT-Transkriptionskaskade zur Amyloid-β-Synaptotoxizität bei [ 49 ].Zusätzlich eine aktive Beteiligung des NFAT-vermittelten Signalwegs an der α-syn-vermittelten Degeneration von Neuronen in der Parkinson-Krankheit [ 50 ]. Tatsächlich besserten sich Patienten mit Parkinson durch das Trinken von H 2 -wasserstoffWasser, wie aus einer doppelblinden, placebokontrollierten klinischen Studie [ 51 ] hervorgeht, und ein größerer Umfang einer klinischen Studie wird derzeit untersucht [ 52 ]. Somit können die vorteilhaften Wirkungen von H 2 auf die neurodegenerativen Erkrankungen durch die Unterdrückung der NFAT-Transkriptionsregulation erklärt werden.

FAZIT

Die vorliegende Studie schlägt eine Möglichkeit zur Verlangsamung des Fortschreitens von Demenz durch H 2 -wasserstoffWasser durch Tierversuche und eine klinische Interventionsstudie für APOE4-Träger vor; Es wird jedoch ein längerer und größerer Umfang von Versuchen erforderlich sein, um die Wirkung von H 2 -wasserstoffWasser auf MCI zu klären.

ANERKENNUNG

Wir danken Blue Mercury, Inc. (Tokio, Japan) für die Bereitstellung von H 2 -wasserstoffWasser und Placebo-Wasser, Hiroe Murakoshi für die technische Unterstützung und Suga Kato für die Sekretariatsarbeit. Finanzielle Unterstützung für diese Studie gewährte die japanische Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (23300257, 24651055 und 26282198 an SO; 23500971 und 25350907 an KN). Finanzielle Unterstützung für diese Studie gewährte die japanische Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (23300257, 24651055 und 26282198 an SO; 23500971 und 25350907 an KN).

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

APOE4 Apolipoprotein E4
MCI Leichte kognitive Einschränkung
ALDH2 Aldehyddehydrogenase 2
ADAS-Zahnrad Alzheimer Disease Assessment Skala-kognitive Subskala
ANZEIGE Alzheimer-Erkrankung
PD Parkinson-Krankheit
DAL101 Dominant negativer Typ 101 des mutierten ALDH2-Polymorphismus (ALDH2 * 2)
4-HNE 4-Hydroxy-2-nonenal
8-OHdG 8-Hydroxy-2′-desoxyguanosin
MDA Malondialdehyd
ORT Objekterkennungsaufgabe
PA Passive Vermeidungsaufgabe
GFAP Glia fibrilläres saures Protein
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
ANOVA Einweg-Varianzanalyse
CI Konfidenzintervall
MMSE Mini Mental State Examination
FOV Sichtfeld
APP Amyloid-Vorläuferprotein
Nrf2 NF-E2-bezogener Faktor 2
NFAT Kernfaktor der aktivierten T-Zelle

 

ERGÄNZUNGSMATERIAL

Ergänzendes Material ist auf der Website des Herausgebers zusammen mit dem veröffentlichten Artikel verfügbar.

ETHISCHE ZULASSUNG UND ZUSTIMMUNG ZUR TEILNAHME

Die Tierstudie wurde vom Animal Care and Use Committee der Nippon Medical School genehmigt.

Das klinische Studienprotokoll für Menschen wurde von den Ethikkommissionen der Universität von Tsukuba genehmigt.

MENSCHEN- UND TIERRECHTE

Alle Tierversuchsverfahren entsprachen den in der achten Ausgabe des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (veröffentlicht von der National Academy of Sciences, National Academies Press, Washington, DC) festgelegten Standards.

Sämtliches menschliches Material wurde in Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki von 1975 festgelegten Standards in der Fassung von 2008 ( http://www.wma.net/en/10ethics/10helsinki/<http://www.wma .net / de / 10ethics / 10helsinki / >).

Zustimmung zur Veröffentlichung

Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung vorrangig für Forschungsuntersuchungen ab.

Curr Alzheimer Res . 15 (5): 482–492.
PMCID: PMC5872374
PMID: 29110615
Auswirkungen von molekularem Wasserstoff anhand eines Tiermodells und einer randomisierten klinischen Studie auf eine leichte kognitive Beeinträchtigung
Kiyomi Nishimaki , 1 Takashi Asada , 2, 3, * Ikuroh Ohsawa , 1, 4 Etsuko Nakajima , 2 Chiaki Ikejima , 2Takashi Yokota , 1 Naomi Kamimura , 1 und Shigeo Ohta 1, 5, *

Zugehörige Daten

Zusatzmaterialien

INTERESSENKONFLIKT

Wir erklären, dass in dieser Studie kein tatsächlicher und potenzieller Interessenkonflikt besteht. Obwohl SO von 2.005 bis 2.008 ein wissenschaftlicher Berater von Blue Mercury, Inc. (Tokio, Japan) war, gab es keine Beteiligung an dieser Studie.

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