Efectos del hidrógeno molecular evaluados por un modelo animal y un estudio clínico aleatorizado sobre deterioro cognitivo leve

Efectos del hidrógeno molecular evaluados por un modelo animal y un estudio clínico aleatorizado sobre deterioro cognitivo leve

Kiyomi Nishimaki , 1 Takashi Asada , 2, 3, * Ikuroh Ohsawa , 1, 4 Etsuko Nakajima , 2 Chiaki Ikejima , 2Takashi Yokota , 1 Naomi Kamimura , 1 y Shigeo Ohta 1, 5, *

Datos asociados

Materiales complementarios

Resumen

Fondo:

El estrés oxidativo es uno de los factores causantes de la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas, incluido el deterioro cognitivo leve (DCL) y la demencia. Anteriormente informamos que el hidrógeno molecular (H2) actúa como un antioxidante terapéutico y preventivo.

Objetivo:

Evaluamos los efectos de beber agua con hidrógeno H2 (agua infundida con hidrógeno molecular H2) en ratones modelo de estrés oxidativo y sujetos con MCI.

Métodos:

Los ratones transgénicos que expresan una forma negativa dominante de aldehído deshidrogenasa 2 se usaron como modelo de demencia. Los ratones con mayor estrés oxidativo se les permitió beber agua con hidrógeno H2.Para un estudio clínico doble ciego controlado con placebo, dominado por rangos, 73 sujetos con DCL bebieron ~ 300 ml de agua con hidrógeno H2 (grupo agua con hidrógeno H2) o agua placebo (grupo control) por día, y la subescala cognitiva de la escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-cog) las puntuaciones se determinaron después de 1 año.

Resultados:

En ratones, beber agua con hidrógeno H2 disminuyó los marcadores de estrés oxidativo y suprimió la disminución del deterioro de la memoria y la neurodegeneración. Además, la esperanza de vida media en el grupo de agua con hidrógeno H2 fue mayor que la del grupo de control. En sujetos con DCL, aunque no hubo diferencias significativas entre los grupos agua con hidrógeno H2 y control en la puntuación ADAS-cog después de 1 año, los portadores del genotipo apolipoproteína E4 (APOE4) en el grupo agua con hidrógeno H2 mejoraron significativamente en el ADAS-cog total puntaje y puntaje de tarea de recuperación de palabras (uno de los subpuntos en el puntaje ADAS-cog).

Conclusión:

El agua con hidrógeno H2 puede tener el potencial de suprimir la demencia en un modelo de estrés oxidativo y en los portadores APOE4 con MCI.

1. INTRODUCCIÓN

El estrés oxidativo es uno de los factores causantes de la patogénesis de las principales enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), el deterioro cognitivo leve (DCL) y la enfermedad de Parkinson (EP) [ 1 , 2 ]. Además, el genotipo de la apolipoproteína E4 (APOE4) es un riesgo genético para la EA, y el aumento del estrés oxidativo en los portadores de APOE4 se considera uno de los modificadores del riesgo [ 3 ].

Para explorar antioxidantes dietéticos efectivos para mitigar la neurodegeneración dependiente de la edad, puede ser útil construir ratones modelo en los que los fenotipos de AD progresen de manera dependiente de la edad en respuesta al estrés oxidativo. Construimos ratones transgénicos DAL101 que expresan un polimorfismo del gen mitocondrial aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2 * 2) [ 4 ]. ALDH2 * 2 es responsable de una deficiencia en la actividad de ALDH2 y es específico de los asiáticos del noreste [ 5 ].Informamos previamente que la deficiencia de ALDH2 es un factor de riesgo para la EA de inicio tardío en la población japonesa, [ 6 ] que fue reproducida por estudios chinos y coreanos en sus respectivas poblaciones [ 7 , 8 ]. Los ratones DAL101 exhibieron una capacidad disminuida para desintoxicar 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) en neuronas corticales y, en consecuencia, una neurodegeneración dependiente de la edad, deterioro cognitivo y una vida útil más corta [ 4 ].

Propusimos que el hidrógeno molecular (H2) tiene potencial como un antioxidante novedoso, [ 9 ] y numerosos estudios han sugerido fuertemente su potencial para aplicaciones preventivas y terapéuticas [ 10– 12 ]. Además de los extensos experimentos con animales, se han informado más de 25 estudios clínicos que examinan la eficacia del H2, [ 11 , 12 ] incluyendo estudios clínicos doble ciego. Según estos estudios, el campo de la medicina del hidrógeno está creciendo rápidamente.

Existen varios métodos para administrar H2, que incluyen inhalar gas hidrógeno (gas H2), beber agua disuelta en H2 (agua con hidrógeno H2) e inyectar solución salina disuelta en H2 (solución salina rica en hidrógeno) [ 13]. Beber agua con hidrógeno H2 previno las deficiencias crónicas inducidas por el estrés en el aprendizaje y la memoria al reducir el estrés oxidativo en ratones [ 14 ] y protege las células neurales al estimular la expresión hormonal de grelina [ 15 ]. Además, la inyección de solución salina rica en hidrógeno mejoró la función de memoria en un modelo de rata de demencia inducida por β-amiloide al reducir el estrés oxidativo [ 16 ].Además, la inhalación de hidrógeno durante la reanimación normóxica mejoró el resultado neurológico en un modelo de rata de paro cardíaco, independientemente del control de temperatura objetivo [ 17 ].

En este estudio, examinamos si beber agua con hidrógeno H2 podría suprimir el deterioro de la memoria dependiente del envejecimiento inducido por el estrés oxidativo en ratones DAL101. A continuación, en un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, investigamos si el agua con hidrógeno H2 podría retrasar la progresión de DCL según lo evaluado por las puntuaciones en la subescala de cognición de la escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-cog) [ 18 , 19 ] desde la línea de base a 1 año. Encontramos una mejora significativa en la cognición a 1 año en los portadores con el genotipo APOE4 en el grupo H 2usando puntajes sub y totales de ADAS-cog.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Aprobación ética y consentimiento para participar

Este estudio con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de Nippon. Los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y reglamentaciones pertinentes.

El protocolo del estudio clínico fue aprobado por los comités de ética de la Universidad de Tsukuba y registrado en la red de información médica del hospital universitario (UMIN) como UMIN000002218 el 17 de julio de 2009 en https://upload.umin.ac.jp/cgi-open -bin / ctr / ctr.cgi? function = history & action = list & type = summary & recptno = R000002-725 & language = J.

Los participantes se inscribieron a partir de julio de 2009. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de las investigaciones de investigación, que se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las revisiones posteriores.

2.2. Ratones transgénicos DAL101

Los ratones transgénicos (DAL101) que expresan un transgen que contiene una versión de ratón de ALDH2 * 2 se construyeron como se describió anteriormente [ 4 ]. Dado que el número de ratones utilizados para cada experimento no era consistente debido a una dificultad de reproducción, se especificó el número de ratones utilizados. Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas con acceso ad libitum a alimentos y agua. Los examinadores realizaron experimentos a ciegas. Dado que no se observó una disminución significativa en el deterioro cognitivo a la edad de 18 meses en ratones de tipo salvaje con el mismo fondo genético (C57BL / 6), [ 4 ] los efectos del agua con hidrógeno H2 no se evaluaron en este estudio.

2.3. Agua de hidrógeno

Para los experimentos con animales, se preparó agua saturada con agua con hidrógeno H2 como se describió anteriormente [ 14]. En resumen, el agua con hidrógeno H2 se disolvió en agua a alta presión (0,4 MPa) a un nivel sobresaturado, y el agua saturada de H2 se almacenó a presión atmosférica en una bolsa de aluminio sin espacio de cabeza. Como control, el agua con hidrógeno H2 fue completamente desgasificada por agitación suave durante un día. Los ratones recibieron agua libremente utilizando recipientes de vidrio cerrados equipados con una línea de salida que contenía dos rodamientos de bolas, lo que evitó que el agua se desgasificara. El recipiente se rellenó recientemente con agua con hidrógeno H2 2 6 días por semana a las 2:00 pm. La concentración de H2 todavía era más de 0.3 mM al día siguiente.

Para este estudio clínico, el agua H 2 disponible comercialmente fue un regalo de Blue Mercury, Inc. (Tokio, Japón). El agua con hidrógeno H2 (500 ml) se empaquetó en una bolsa de aluminio sin espacio de cabeza para mantener la concentración de H2, y se esterilizó a 80 ° C durante 30 minutos. La concentración de H2 se midió utilizando un sensor de hidrógeno (Unisense, Aarhus N, Dinamarca), y se usó si el valor era superior a 0,6 mM. Blue Mercury Inc. también proporcionó agua placebo en un paquete idéntico (500 ml). Esta empresa no desempeñó ningún papel en la recopilación de datos, gestión, análisis o interpretación de los datos. Se proporcionó un paquete con 500 ml de placebo o H2O por día después de mostrar los paquetes vacíos anteriores, mediante el cual las tasas de cumplimiento autoinformadas en el grupo de intervención se calcularon como el volumen de H2O en 1 año.

2.4. Medición del estrés oxidativo

Como marcador de estrés oxidativo, se midió 8-OHdG [ 20 ] utilizando muestras de orina, que se recogieron entre las 9:00 y las 10:00 am como se describió anteriormente [ 21 ], utilizando un inmunoensayo competitivo ligado a enzimas (Nuevo 8-OHdG check; Instituto Japonés para el Control del Envejecimiento, Shizuoka, Japón). Los valores se normalizaron mediante la concentración de creatinina en orina, que se analizó utilizando un kit estándar (Wako, Kyoto, Japón). Como marcador adicional de estrés oxidativo en el cerebro, se determinó la MDA acumulada usando un kit de ensayo Bioxytech MDA-586 (Percipio Biosciences, CA, EE. UU.). Los niveles de malondialdehído (MDA) se normalizaron frente a las concentraciones de proteínas.

2.5. Medición del deterioro de la memoria: tarea de reconocimiento de objetos

Las habilidades de aprendizaje y memoria se examinaron mediante la tarea de reconocimiento de objeciones (ORT) [ 4 ]. Se habituó un ratón en una jaula durante 4 h, y luego se presentaron dos objetos de diferentes formas al ratón durante 10 minutos como entrenamiento. El número de veces de exploración y / o olfateo de cada objeto se contó durante los primeros 5 minutos (prueba de entrenamiento). Las frecuencias (%) en la prueba de entrenamiento se consideraron como antecedentes. Para probar la retención de memoria después de 1 día, uno de los objetos originales fue reemplazado por uno nuevo de una forma diferente y luego los tiempos de exploración y / o inhalación se contaron durante los primeros 5 minutos (prueba de retención). Cuando los ratones pierden habilidades de aprendizaje y memoria, las frecuencias de exploración y / o inhalación de cada objeto deben ser iguales (aproximadamente 50%) en la sesión de entrenamiento, lo que indica que los ratones mostraron un interés similar en cada objeto debido a la falta de memoria para el objeto. objetos. Las habilidades de aprendizaje y memoria se evaluaron como la resta de las frecuencias (%) en la prueba de retención de cada fondo (prueba de entrenamiento).

2.6. Medición del deterioro de la memoria: tarea de evitación pasiva (PA)

El aparato constaba de dos compartimentos, uno claro y otro oscuro, separados por una puerta corredera vertical [ 22 ]. En el día 1, inicialmente colocamos un mouse en el compartimento de luz durante 20 s.Después de que se abrió la puerta, el ratón podía entrar en el compartimento oscuro (los ratones instintivamente prefieren estar en la oscuridad). En el día 2, el mouse se colocó nuevamente en la sección clara para permitir que el mouse se mueva a la sección oscura. Después de que el ratón entró en el compartimento oscuro, la puerta se cerró. Después de 20 s, el ratón recibió una descarga eléctrica de 0,3 mA durante 2 s. Se permitió que el ratón se recuperara durante 10 segundos y luego se devolvió a la jaula de la casa. El día 3, 24 horas después del choque, el mouse se colocó nuevamente en la sección clara con la puerta abierta para permitir que el mouse se mueva a la sección oscura. Examinamos el tiempo de latencia para atravesar la puerta. Las habilidades de aprendizaje y memoria se evaluaron como la resta de los tiempos de latencia después de la descarga eléctrica de cada fondo (antes).

2.7. Inmunotinción de la región del hipocampo CA1

Para examinar la pérdida neuronal y la activación glial, la región del hipocampo se tiñó con un anticuerpo anti-NeuN piramidal específico de neurona (clon A60; Merck Millipore, Darmstadt, Alemania), una proteína ácida fibrilar antiglial específica de astrocitos (anti-GFAP) anticuerpo (Thermo Scientific, MA, EE. UU.) o un anticuerpo anti-IbaI específico de microglia (Wako). Los ratones fueron perfundidos transcardialmente para ser fijados con paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) bajo anestesia, y sus cerebros fueron crioprotegidos con sacarosa al 30%, y luego el cerebro congelado se seccionó a 8 μm de espesor. Después de la incubación con cada anticuerpo primario, las secciones se trataron con anticuerpos secundarios (Vector Laboratories, CA, EE. UU.) Y su inmunorreactividad se visualizó mediante el método del complejo avidina-biotina (Vector Laboratories).

2.8. Sujetos del estudio clínico

Este estudio fue un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo realizado como parte del proyecto Tone, un estudio epidemiológico en curso realizado en Tone Town, Ibaraki, Japón, como se describe en detalle anteriormente [ 23 , 24 ]. Esta ciudad está ubicada aproximadamente a 40 km al noreste del centro de Tokio y consta de 22 distritos. La encuesta de línea de base del proyecto Tone incluyó a 1.032 participantes en julio de 2009, y los sujetos del presente estudio fueron reclutados de estos participantes.

Los criterios de elegibilidad son la edad de 67 años o más, pudiendo dar un consentimiento informado por escrito para participar en el presente estudio, con un diagnóstico de DCL, pudiendo observar el siguiente requisito: buen cumplimiento del consumo de agua; participación en los exámenes programados para evaluación; mantener un registro diario del consumo de agua, con un puntaje isquémico de Hachinski modificado de 4 o menos y un puntaje de la Escala de depresión geriátrica de 15 ítems de 6 o menos. En resumen, 3 meses antes de este estudio clínico, todos los participantes se sometieron a una evaluación grupal que utilizó un conjunto de 5 pruebas que midieron los siguientes dominios cognitivos: atención;memoria; función visuoespacial; idioma; y razonamiento como se describió anteriormente [ 25 ]. Deterioro objetivo en al menos 1 dominio cognitivo basado en el promedio de los puntajes en las medidas neuropsicológicas dentro de ese dominio y 1 corte de DE utilizando correcciones normativas por edad, años de educación y sexo.

Los criterios de exclusión tenían los criterios del “Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales (DSM) -IV TR” para enfermedades demenciales, enfermedades graves o inestables, antecedentes en los últimos 5 años de enfermedades infecciosas graves que afectan el cerebro y / o enfermedades malignas. , antecedentes de abuso o dependencia de alcohol o drogas (en DSM-IV TR) en los últimos 5 años, y recibir cualquier tipo de medicamentos contra el Alzheimer y el inicio reciente (dentro de 4 semanas) de medicamentos que afectan el sistema nervioso central. Cuando la puntuación del Mini examen del estado mental (MMSE) [ 26 ] fue inferior a 24, los sujetos fueron excluidos.

En este estudio, los sujetos fueron asignados aleatoriamente a un grupo de intervención, que recibió agua H 2 todos los días durante 1 año, o un grupo de control, que recibió agua placebo. La secuencia de asignación se determinó mediante números aleatorios generados por computadora que se ocultaron a los investigadores y los sujetos. Los Dres. Nakajima e Ikejima generaron la secuencia de asignación aleatoria, los participantes inscritos y los participantes asignados a las intervenciones. Todos los participantes y proveedores de atención fueron enmascarados ciegamente

En el protocolo original, planeamos administrar agua con hidrógeno H2 durante 2 años y evaluar los resultados secundarios; sin embargo, tuvimos que detener el proyecto en 2011 por el desastre del tsunami y no pudimos obtener los datos de 2 años y los resultados secundarios.

El genotipo APOE4 se determinó como se describe [ 25 ].

2.9. Consideraciones estadísticas

Todos los análisis estadísticos fueron realizados por un bioestadista académico utilizando el software SAS versión 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, EE. UU.). Los resultados se consideraron significativos en p<0.05.

Para la comparación de dos grupos en las habilidades de aprendizaje y memoria, y la esperanza de vida, se usó la prueba t de Student de dos colas sin emparejar para la comparación del grupo agua con hidrógeno H2 con el grupo control. Para los otros experimentos con animales, se aplicó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con análisis post hoc de Tukey-Kramer o Dunnett a menos que se mencione lo contrario.

Para el ensayo clínico, planeamos reclutar un total de 120 pacientes, lo que proporcionaría un poder del 90% para detectar un tamaño del efecto de 0.6 usando una prueba de dos lados con un nivel de significancia del 5%, pero el tamaño real de la muestra para el análisis primario era 73, lo que lleva a un 70% de potencia en la misma configuración. Los puntos finales fueron puntajes en la versión japonesa de ADAS-cog a 1 año, y los cambios fueron evaluados por la prueba U de Mann-Whitney (análisis no paramétrico) así como por la prueba t de Student (análisis paramétrico).

3. RESULTADOS

3.1. Estrés oxidativo reducido de hidrógeno-agua en ratones DAL

A los ratones DAL101 machos se les administró agua con hidrógeno H2 o agua de control para beber ad libitum desde la edad de 1 mes, y continuaron hasta la edad de 18 meses. El grupo H 2- water DAL101 mostró una disminución significativa en el nivel de un marcador de estrés oxidativo, 8-hidroxi-2′-desoxiguanosina urinaria (8-OHdG) [ 20 ] a la edad de 14 meses (Supl. Fig. S1A ). Además, los ratones DAL101 aumentaron el estrés oxidativo en el cerebro medido por el nivel de MDA como un marcador de estrés oxidativo alternativo, y el agua con hidrógeno H2 mostró una recuperación significativa de este nivel aumentado de MDA en ratones DAL101 (Supl. Fig. S1B ).

3.2. El agua de hidrógeno suprimió una disminución en el aprendizaje y el deterioro de la memoria

Examinamos las habilidades de aprendizaje y memoria usando ORT [ 4 ]. Como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS , las habilidades de aprendizaje y memoria se evaluaron como la resta de la frecuencia (%) en la prueba de retención de cada fondo (prueba de entrenamiento). A los ratones se les proporcionó control o agua con hidrógeno H2 desde la edad de 1 mes. A la edad de 14 meses, el grupo agua con hidrógeno H2 memorizó significativamente los objetos originales y mostró la preferencia por el nuevo objeto más que el grupo de control (Fig. 1A 1A, 14 meses ).

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El agua de hidrógeno evitó el deterioro cognitivo. Se suministró agua con hidrógeno H2 a partir de la edad de 1 mes ( A, C) y de la edad de 8 meses ( B ). Los ratones fueron sometidos a la primera tarea de reconocimiento de objeciones (TRO) a la edad de 14 meses ( A, B, 14 meses ) y la segunda TRO a la edad de 18 meses ( A, B, 18 meses) ) Los índices de reconocimiento se obtuvieron como la frecuencia (%) de explorar y / o olfatear el objeto que sería reemplazado o el nuevo que había sido reemplazado. Δ El índice de reconocimiento (%) indica las frecuencias en la prueba de retención de ORT después de la resta de las de la prueba de entrenamiento (antecedentes). WT, tipo salvaje; (DAL, H 2 -), ratones DAL101 que beben agua de control desgasificada;(DAL, H2 +), ratones DAL101 bebiendo agua de hidrógeno. Los datos se muestran como la media ± SEM. n = 9, * p <0.05, ** p <0.01 por la prueba t de Student. C ) Los ratones fueron sometidos a una tarea de evitación pasiva. Las latencias paso a paso antes y después de la descarga eléctrica se obtienen y Δ La latencia (s) paso a paso indica la resta de las latencias paso a paso después de antes de la descarga eléctrica. WT, tipo salvaje (n = 10); Ratones DAL, H 2 -, DAL101 que reciben agua de control desgasificada (n = 8); y ratones DAL, H 2 +, DAL101 que reciben agua con hidrógeno H2 (n = 8). Los datos se muestran como la media ± SEM. p <0,05.

A la edad de 18 meses, los ratones fueron sometidos a la segunda TRO, que se puede hacer utilizando diferentes objetos a la edad de 18 meses [ 14 ]. Los ratones DAL101 de edad avanzada que bebieron agua con hidrógeno H2 todavía memorizaron significativamente los objetos originales y prefirieron el novedoso más que el grupo de control (Fig. 1A 1A, 18 meses ).

A continuación, para probar los efectos del consumo de agua con hidrógeno H2 en la etapa posterior, comenzamos a administrar agua H2 a ratones DAL101 machos a la edad de 8 meses en lugar de 1 mes, y sometidos a ORT a la edad de 14 meses ( Fig. 1B 1B de 14 meses de edad ) y el segundo ORT a la edad de 18 meses (Fig. 1B 1B de 18 meses de edad ). Incluso cuando los ratones comenzaron a beber a la edad de 8 meses, el agua con hidrógeno H2 suprimió significativamente la disminución de las habilidades de aprendizaje y memoria a la edad de 18 meses, así como a la edad de 14 meses (Fig. 1B 1B ) .

Además, sometimos a los ratones a PA [ 22 ] a la edad de 18 meses como método alternativo. Un día después de que se administró una descarga eléctrica de 0,3 mA durante 2 s, los ratones C57BL / 6 de tipo salvaje memorizaron la descarga según se evaluó mediante la sustracción de los tiempos de latencia para volver a ingresar al compartimento oscuro de cada fondo (Fig. 1C1C ). El grupo  H2 -agua con hidrógeno suprimió significativamente la disminución en el aprendizaje y la memoria más que el grupo control (Fig. 1C 1C ).

Por lo tanto, beber agua con hidrógeno H2 suprimió el deterioro del aprendizaje y la memoria en los ratones con estrés oxidativo.

3.3. Neurodegeneración suprimida de hidrógeno y agua

Para examinar si el agua con hidrógeno H2 podría prevenir la neurodegeneración en ratones DAL101 de edad avanzada, teñimos el hipocampo con un anticuerpo anti-NeuN específico de neurona (Fig. 2A 2A ). La neurodegeneración se evaluó mediante activaciones gliales usando un anticuerpo anti-GFAP y un anticuerpo anti-Iba-I específico de microglia. Las células inmuno positivas por campo de visión (FOV) se contaron en la región CA1 (Fig. 2B 2B ).

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El agua hidrogenada suprimió la neurodegeneración. A ) La región CA1 del hipocampo se tiñó con anticuerpos contra NeuN (un marcador neuronal), GFAP (un marcador astrocítico) o Iba-1 (un marcador microglial) (barras de escala: 50 µm). Los paneles de la derecha muestran imágenes ampliadas de los cuadrados en los paneles de la izquierda (barras de escala: 10 µm). B ) Las células positivas para anticuerpos anti-NeuN, anti-GFAP y anti-Iba-I por campo de visión (FOV) se contaron en la región CA1 (n = 5). Los datos se muestran como la media ± DE. p <0.05, ** p <0.01 (tipo salvaje vs DAL), # p <0.05 (H2  agua vs. control de agua en DAL).

El número de neuronas disminuyó en el grupo de control DAL101 como comparación con el grupo de tipo salvaje, y el grupo H 2 -DAL101 mostró una tendencia en la recuperación de la disminución (Fig. 2A 2A ).Como se ha descrito anteriormente, [ 4 ] los ratones control DAL101 exhibieron un aumento en la activación glial, y el grupo H2  agua suprimió la activación glial mejorada en la región CA1 (Fig. 2 2 , GFAP e Iba-I).

3.4. Hidrógeno-agua extendió la vida útil promedio de los ratones

DAL101 ratones mostraron una vida útil más corta, que también se ha descrito anteriormente [ 4 ]. Para examinar si el consumo de agua H2 atenuó la vida útil acortada, las hembras ratones DAL101 comenzaron a beber control o agua H2 a la edad de 1 mes. Aunque el agua H2 no extendió la vida útil máxima (Fig. 3A 3A ), el agua H2 extendió significativamente la vida media de los ratones DAL101 (Fig. 3B 3B ).

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Extensión de la vida útil promedio mediante el consumo continuo de agua con hidrógeno H2 . A ) Curva de Kaplan-Meier que representa la supervivencia de ratones hembra C57BL / 6 (tipo salvaje), ratones hembra DAL101 que beben agua de control (agua de control) y agua H2 (agua H2). B ) Cada punto indica la vida útil de cada mouse. Las barras indican la vida media de cada grupo. p < 0.05 (p = 0.036) por la prueba t de Student.

3.5. Un estudio clínico aleatorizado, controlado con placebo

La figura (4 4 ) muestra el perfil del reclutamiento, la aleatorización y el seguimiento de este estudio. Un total de 81 sujetos de los 1,032 participantes fueron asignados al azar; sin embargo, 3 en el grupo control y 5 en el grupo de intervención fueron diagnosticados como no elegibles después de la aleatorización y no se incluyeron en este análisis. Las características basales y los factores de estilo de vida se equilibraron entre los grupos de estudio (Tabla 1 1 ). La asignación aleatoria se estratificó por edad de ~ 74 años y puntaje MMSE de ~ 28 puntos. La tasa de cumplimiento promedio del agua potable se estimó en 64% en ambos grupos a 1 año, lo que significa que los sujetos bebieron 320 ml / día en promedio. Las puntuaciones medias totales de ADAS-cog en los grupos agua con hidrógeno H2 y control fueron 8.04 y 7.89, respectivamente, sin significación.

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Perfil del reclutamiento, aleatorización y seguimiento de este estudio. Este estudio fue un ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo realizado como parte del proyecto Tone, un estudio epidemiológico en curso realizado en Tone Town, Ibaraki, Japón [ 23 , 24 ].

tabla 1

Características de fondo de 73 sujetos con deterioro cognitivo leve.

Control (n = 38) Intervención (n = 35)
Media SD o% Media SD o%
Mujer * 20 (52,6%) 19 (54,3%)
Años de edad) 74,45 5.44 73,97 5.11
Índice de masa corporal (kg / m 2 ) 23,55 2,59 23,19 4.08
Presión arterial sistólica (mmHg) 131,26 12,35 135,14 13,31
Presión arterial diastólica (mmHg) 77,92 7.13 78,89 9.53
Educación (años) 11,26 2,71 11,57 2,83
Bebedor de alcohol actual * 19 (50,0%) 14 (40,0%)
Actual fumador * 4 4 (10,5%) 5 5 (14,3%)
Hábito actual de ejercicio * 27 (71,1%) 22 (62,9%)
APOE4 carrier * 6 6 (15,7%) 7 7 (20,0%)
Historia familiar * 2 (5,3%) 2 (5,7%)
Comorbilidad *
Hipertensión 15 (39,5%) 14 (40,0%)
Diabetes mellitus 4 4 (10,5%) 5 5 (14,3%)
Dislipidemia 4 4 (10,5%) 4 4 (11,4%)
Carrera 2 (5,3%) 1 (2.9%)
Depresión 1 (2.6%) 2 (5,7%)
MMSE 28,08 1,66 27,83 1,74
ADAS-cog 7.89 3.19 8.04 3,47

* indica frecuencia (%).

Después de 1 año, no se encontraron daños observables o efectos no deseados en cada grupo, y hubo una tendencia a mejorar la puntuación total de ADA-cog tanto en los grupos agua con hidrógeno H2 y de control (Supl. Tabla S1 ), probablemente debido a intervenciones tales como ejercicio moderado por el proyecto Tone. Además, los sujetos en el grupo agua con hidrógeno H2 tenían más tendencias para la mejora que aquellos en los grupos de control, aunque no hubo significación (Supl. Tabla S1 ). Sin embargo, cuando prestamos atención a los cambios de puntaje en los portadores del genotipo APOE4, los puntajes totales de las tareas de recuperación de palabras y de ADAS (uno de los subpuntos) mejoraron significativamente según lo evaluado por la distribución del cambio de puntaje en cada sujeto ( Figura 5 5 ). En los portadores APOE4, el grupo agua con hidrógeno H2 mejoró significativamente, mientras que el grupo control empeoró ligeramente. shows the score change of each subject as an alternative presentation.Además, la figura6 6 ) muestra el cambio de puntaje de cada sujeto como una presentación alternativa. Aunque los sujetos en el grupo de control no mejoraron, seis y cinco de los 7 sujetos mejoraron en el puntaje total de ADAS y los puntajes de tareas de recuperación de palabras, respectivamente, en el grupo agua con hidrógeno H2 de los portadores de APOE4.

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Distribución de cambios de puntaje sub y total de ADAS-cog. Distribución de la puntuación de la tarea de recuerdo de cambio de palabra ( A ), una sub-puntuación de ADAS-cog y ( B ) puntuación total de ADAS-cogs en APOE4 no portadores (izquierda) y APOE4 portadores (derecha). Cada punto indica el cambio de sujetos individuales. La diferencia entre los grupos agua con hidrógeno H2 y control fue significativa en los portadores de APOE4 mediante un análisis no paramétrico y un análisis paramétrico. A ) p = 0.036 (por la prueba t de Student) y p= 0.047 (por la prueba U de Mann-Whitney) y ( B ) p = 0.037 (por la prueba t de Student) y p = 0.044 (por la prueba U de Mann-Whitney ) para ( A ) y ( B ), respectivamente. Las barras del medio en las pastillas indican valores medios.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es CAR-15-482_F6.jpg

Cambios en una puntuación sub-dolor y puntuación ADAS-cog total de cada sujeto en los portadores APOE4. Cada línea indica el cambio de 1 año en el puntaje de la tarea de recuperación de palabras ( A ) y el puntaje total de ADAS-cog ( B ) de un sujeto en los portadores APOE4. * indica p <0.05 como se muestra en la leyenda de la Fig.5.

DISCUSIÓN

Los trastornos neurodegenerativos dependientes de la edad están involucrados en el estrés oxidativo. En este estudio, mostramos que beber

El agua con hidrógeno H2 suprimió el declive bioquímico, conductual y patológico en ratones con estrés oxidativo. La puntuación de ADAS-cog [ 18 ] es la medida cognitiva general más ampliamente utilizada en ensayos clínicos de AD [ 27 , 28 ]. El puntaje ADAS-cog evalúa múltiples dominios cognitivos que incluyen memoria, lenguaje, praxis y orientación. En general, el ADAS-cog ha demostrado ser exitoso para su propósito previsto. El presente estudio clínico muestra que beber agua H 2 mejoró significativamente la puntuación ADAS-cog de los portadores del genotipo APOE4.

Anteriormente hemos demostrado que los ratones DAL101 muestran neurodegeneración dependiente de la edad y deterioro cognitivo y acortan la vida útil [ 4 ]. Los ratones DAL101 exhiben fenotipos de demencia de una manera dependiente de la edad en respuesta a una cantidad creciente de estrés oxidativo [ 4 ]. El estrés oxidativo mejora la peroxidación lipídica, lo que lleva a la formación de aldehídos α, β-insaturados altamente reactivos, como MDA y 4-HNE [ 29 ]. Se ha observado la acumulación de proteínas 4-HNE-aducidas en neuronas piramidales en los cerebros de pacientes con EA y EP [ 30 ]. La disminución de la capacidad de ALDH2 * 2 no logró desintoxicar los aldehídos citotóxicos y, en consecuencia, aumenta el estrés oxidativo [ 31 ].

Además, se construyeron ratones doblemente transgénicos cruzando ratones DAL101 con ratones Tg2576, que expresan una forma mutante de proteína precursora amiloide humana (APP). Mostraron deposición acelerada de amiloide, fosforilación de tau y gliosis, así como dificultades de aprendizaje y memoria. La vida útil de los ratones APP / DAL fue significativamente más corta que la de los ratones APP y DAL101 [ 32 ]. Por lo tanto, estos animales modelo pueden ser útiles para explorar antioxidantes que podrían prevenir la demencia dependiente de la edad. De hecho, una dieta que contiene Chlorella mostró efectos mitigados sobre el deterioro cognitivo en DAL101 [ 33 ].

Uno de los factores de riesgo más potentes para la EA es el estado de portador del genotipo APOE4, y los roles de APOE4 en la progresión de la AD han sido ampliamente examinados desde varios aspectos [ 34 , 35 ]. APOE4 también aumenta el número de lipoproteínas aterogénicas y acelera la aterogénesis [ 36 ]. El aumento del estrés oxidativo en los portadores de APOE4 se considera uno de los modificadores del riesgo [ 3 ]. Una combinación de antioxidantes mejoró la función cognitiva de sujetos de edad avanzada después de 3 años, especialmente en portadores de APOE4 [ 23 ]. Este resultado clínico anterior concuerda con el presente estudio. El agua con hidrógeno H2 actúa como un antioxidante eficiente dentro de las células debido a su capacidad de difundirse rápidamente a través de las membranas [ 9 ]. Además, como función antioxidante secundaria, el H2 parece activar el factor 2 relacionado con NF-E2 (Nrf2), [ 10 ] que reduce el estrés oxidativo mediante la expresión de una variedad de enzimas antioxidantes [ 37 ]. Informamos que beber H2agua con hidrógeno   previno la arteriosclerosis usando ratones knockout APOE, un modelo del desarrollo espontáneo de la aterosclerosis que acompaña a una disminución del estrés oxidativo [ 38 ]. Por lo tanto, es posible que beber agua con hidrógeno H2 mejore el daño vascular al disminuir el estrés oxidativo como antioxidante directo o indirecto, lo que lleva a la mejora de un modelo de demintia y sujetos con DCL. En este estudio, nos centramos en el genotipo de las isoformas APOE; sin embargo, el polimorfismo del gen APOE en la región promotora influye en la expresión del gen APOE [ 39 ]. Por lo tanto, será importante examinar el efecto del agua con hidrógeno H2 bajo este polimorfismo.

Para mitigar la EA, se ha prestado una atención considerable al ejercicio regular y moderado para ayudar a reducir el riesgo de demencia y evitar el desarrollo de DCL en pacientes de edad avanzada [ 40 – 42 ]. El ejercicio moderado mejora el metabolismo energético y suprime la expresión de citocinas proinflamatorias [ 43 ] y protege los sistemas vasculares [ 40 , 44 , 45 ]. El H2 exhibe múltiples funciones por una disminución en los niveles de citocinas proinflamatorias y un aumento en el metabolismo energético además de los roles antioxidantes. Para ejercer múltiples funciones, H 2 regula varias vías de transducción de señales y la expresión de muchos genes [ 10 ]. Por ejemplo, el H2 protege las células neurales y estimula el metabolismo energético estimulando la expresión hormonal de grelina [ 15 ] y el factor de crecimiento de fibroblastos 21, [ 21 ] respectivamente. En contraste, el H2 alivia la inflamación al disminuir las citocinas proinflamatorias [ 46 ]. Por lo tanto, la combinación de estas funciones de H2 en la antiinflamación y la estimulación del metabolismo energético podrían prevenir la disminución de la función cerebral, [ 10 ] las cuales se mejoran con el ejercicio regular y moderado. Por lo tanto, es posible que las funciones multipe de H2, incluida la estimulación del metabolismo energético y la antiinflamación, puedan contribuir a la mejora del modelo de demencia y los sujetos con DCL.

Como aspecto alternativo, el H2 suprime el factor nuclear de la vía de transcripción de células T activadas (NFAT) para regular varios patrones de expresión génica [ 47 ]. La señalización de NFAT se altera en la EA y juega un papel importante en la conducción de la neurodegeneración mediada por β-amiloide [ 48 ].Además, la cascada transcripcional NFAT contribuye a la sinaptotoxicidad β amiloide [ 49 ]. Además, una participación activa de la vía de señalización mediada por NFAT en la degeneración de neuronas mediada por α-syn en la EP [ 50 ]. De hecho, los pacientes con EP mejoraron al beber agua H2, como lo revela un estudio clínico doble ciego controlado con placebo, [ 51 ] y se está investigando una mayor escala de un ensayo clínico [ 52 ]. Por lo tanto, los efectos beneficiosos de H2 en las enfermedades neurodegenerativas pueden explicarse por la supresión de la regulación transcripcional de NFAT.

CONCLUSIÓN

El presente estudio sugiere una posibilidad de retrasar el progreso de la demencia al beber agua con hidrógeno H2 por medio de experimentos con animales y un estudio de intervención clínica para portadores de APOE4; sin embargo, será necesaria una escala de ensayos más larga y más grande para aclarar el efecto del agua con hidrógeno H2 en el DCL.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Agradecemos a Blue Mercury, Inc. (Tokio, Japón) por proporcionar agua con hidrógeno H2 y agua placebo, a la Sra. Hiroe Murakoshi por su asistencia técnica y a la Sra. Suga Kato por su trabajo de secretaría. El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por Grants-in-Aid for Scientific Research de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (23300257, 24651055 y 26282198 a SO; 23500971 y 25350907 a KN). El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por Grants-in-Aid for Scientific Research de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (23300257, 24651055 y 26282198 a SO; 23500971 y 25350907 a KN).

LISTA DE ABREVIACIONES

APOE4 Apolipoproteína E4
MCI Defecto cognitivo leve
ALDH2 Aldehído deshidrogenasa 2
ADAS-cog Escala de evaluación de la enfermedad de Alzheimer subescala cognitiva
ANUNCIO Enfermedad de Alzheimer
PD Enfermedad de Parkinson
DAL101 Negativo dominante tipo 101 del polimorfismo mutante ALDH2 (ALDH2 * 2)
4-HNE 4-hidroxi-2-nonenal
8-OHdG 8-hidroxi-2′-desoxicoguanosina
MDA Malondialdehído
ORT Tarea de reconocimiento de objetos
Pensilvania Tarea de evitación pasiva
GFAP Proteína ácida fibrilar glial
PBS Solución salina tamponada con fosfato
ANOVA Análisis de varianza de una sola vía
CI Intervalo de confianza
MMSE Mini examen del estado mental
FOV Campo de visión
APP Proteína precursora amiloide
Nrf2 Factor 2 relacionado con NF-E2
NFAT Factor nuclear de células T activadas

 

MATERIAL SUPLEMENTARIO

El material complementario está disponible en el sitio web del editor junto con el artículo publicado.

APROBACIÓN DE ÉTICA Y CONSENTIMIENTO PARA PARTICIPAR

El estudio en animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de Nippon.

El protocolo de estudio clínico humano fue aprobado por los comités de ética de la Universidad de Tsukuba.

DERECHOS HUMANOS Y ANIMALES

Todos los procedimientos de investigación en animales seguidos estaban de acuerdo con los estándares establecidos en la octava edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por la Academia Nacional de Ciencias, The National Academies Press, Washington, DC).

Todo el material humano se obtuvo de acuerdo con los estándares establecidos en los principios de la Declaración de Helsinki de 1975, revisados ​​en 2008 ( http://www.wma.net/en/10ethics/10helsinki/<http://www.wma .net / es / 10ethics / 10helsinki / >).

Consentimiento para publicación

Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito a las investigaciones de investigación.

CONFLICTO DE INTERESES

Declaramos que no hay conflicto de intereses real y potencial en este estudio. Aunque SO fue asesor científico de Blue Mercury, Inc. (Tokio, Japón) de 2,005 a 2,008, no hubo participación durante este estudio.

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