acqua idrogenata per pazienti con ulcera da pressione e suoi effetti ricostruttivi sulle cellule della pelle umana

 

sfondo

L’ulcera da decubito (PU) è comune nei pazienti anziani immobili e ci sono alcuni lavori di ricerca per studiare un metodo preventivo e curativo, ma non per trovare un’efficacia sufficiente. Lo scopo di questo studio è di chiarire l’efficacia clinica sulla guarigione delle ferite nei pazienti con PU mediante assunzione di acqua disciolta con idrogeno / acqua idrogenata (HW) tramite alimentazione tubolare (TF). Inoltre, i normali fibroblasti cutanei umani OUMS-36 e i normali cheratinociti HaCaT della linea cellulare derivata dall’epidermide umana sono stati esaminati in vitro per esplorare i meccanismi relativi al fatto che l’idrogeno svolga un ruolo nella guarigione delle ferite a livello cellulare.

metodi

Nel presente studio sono stati reclutati 22 pazienti giapponesi anziani gravemente ospedalizzati con PU, e la loro età era compresa tra 71,0 e 101,0 (86,7 ± 8,2) anni, 12 pazienti maschi e 10 femmine, tutti affetti da disturbi alimentari e sindrome da letto come risultati secondari di varie malattie sottostanti. Tutti i pazienti hanno ricevuto trattamenti di cura di routine per PU in combinazione con l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF per 600 ml al giorno, al posto di un parziale rifornimento di umidità. D’altra parte, HW / acqua idrogenata è stato preparato con un apparato gorgogliante di idrogeno che produce HW con 0,8-1,3 ppm di concentrazione di idrogeno disciolto (DH) e da -602 mV a -583 mV di potenziale di riduzione dell’ossidazione (ORP), in contrasto con l’inversione acqua osmotica ultra pura (RW), come riferimento, con DH di <0,018 ppm e ORP di +184 mV per l’uso nella ricerca sperimentale in vitro . In esperimenti in vitro , i fibroblasti OUMS-36 e i cheratinociti HaCaT sono stati rispettivamente coltivati ​​in terreno preparato con HW / acqua idrogenata e / o RW. Immunostain è stato usato per rilevare la ricostruzione del collagene di tipo I nelle cellule OUMS-36. E le specie intracellulari di ossigeno reattivo (ROS) sono state quantificate mediante saggio NBT e la vitalità cellulare delle cellule HaCaT è stata esaminata mediante saggio WST-1, rispettivamente.

risultati

Ventidue pazienti sono stati divisi retrospettivamente in un gruppo efficace (EG, n = 12) e un gruppo meno efficace (LG, n = 10) in base agli esiti della valutazione dell’endpoint e ai criteri di guarigione. I giorni ospedalizzati in PU in EG erano significativamente più brevi rispetto a LG (113,3 giorni contro 155,4 giorni, p <0,05) e il tasso di accorciamento era di circa il 28,1%. Sia in EG che in LG, le variazioni riducenti (EG: 91,4%; LG: 48,6%) delle dimensioni della ferita hanno rappresentato una differenza statisticamente significativa rispetto all’assunzione di HW / acqua idrogenata ( p <0,05, p <0,001). I dati in vitro dimostrano che i ROS intracellulari quantificati dal dosaggio NBT sono diminuiti di HW / acqua idrogenata , ma non di RW, nelle cellule HaCaT irradiate da ultravioletti A (UVA). La condensazione e la frammentazione nucleari si erano verificate per le cellule HaCaT irradiate da UVA in RW, ma si erano appena verificate in HW / acqua idrogenata , come dimostrato dalla colorazione Hoechst 33342. Inoltre, sotto l’irradiazione UVA, la capacità di riduzione mitocondriale delle cellule HaCaT o la costruzione di collagene di tipo I nelle cellule OUMS-36 si sono deteriorate nel mezzo di coltura preparato con RW, ma è stata mantenuta nel mezzo di coltura preparato con HW / acqua idrogenata come mostrato da WST-1 dosaggio o immunostain, rispettivamente.

conclusioni

È stato dimostrato che l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF, per pazienti anziani gravemente ricoverati in ospedale con PU, esegue la riduzione della dimensione della ferita e il recupero precoce, che sono potuti derivare dalla costruzione di collagene di tipo I nei fibroblasti cutanei o dalla promossa capacità di riduzione dei mitocondri e dalla repressione dei ROS nei cheratinociti epidermici come mostrato rispettivamente da immunostain o NBT e WST-1.

introduzione

La PU è comune negli anziani immobili o in altri pazienti immobili affetti da malattie come lesioni del midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica, sclerosi multipla e distrofia muscolare, ecc. Inoltre, i pazienti anziani e deboli costretti a letto appartengono a una popolazione ad alto rischio per la PU [ 1 ]. Si stima che ci siano oltre un milione di anziani che soffrono delle peculiarità della pelle e si trovano ad affrontare i fattori di rischio della PU negli Stati Uniti [ 2 ]. Fondamentalmente, di solito si sottolinea che le spese sociali, psicologiche e finanziarie per la PU sono incommensurabili, i pazienti, le loro famiglie e gli operatori sanitari sono sempre sottoposti a stress mentale [ 3 ].

Per la PU, è un compito di ricerca primario esplorare un metodo preventivo ma curativo economico ma efficace. Sebbene siano stati sviluppati vari metodi per la prevenzione e il trattamento, essi sono lungi dall’essere sufficientemente efficaci. Sebbene leggermente ritardati, gli studi di base procedono costantemente allo stesso modo dello studio clinico. Come studi di base per la guarigione delle ferite, molti ricercatori si stanno concentrando sulle proteine ​​che costruiscono la pelle come collagene, elastina, laminina e fibronectina e sull’attività metabolica e sulla capacità proliferante dei fibroblasti cutanei [ 4 , 5 ].

In relazione a questa questione, avevamo confermato il fatto che HW / acqua idrogenata , come uso esterno per la pelle, può promuovere la costruzione del collagene di tipo I nelle cellule fibroblastiche del derma [ 6 – 8 ]. Abbiamo preparato HW / acqua idrogenata con un apparato gorgogliante di idrogeno, esibendo un DH di 1,13 ppm e un ORP di -741 mV, al contrario un DH di <0,01 ppm e un ORP di +150 mV per l’acqua normale [ 6 ]. Allo stesso tempo, normali fibroblasti cutanei umani OUMS-36 e normali cheratinociti derivati ​​dall’epidermide umana HaCaT sono stati coltivati ​​usando un immunostain, inoltre sono state condotte colorazioni WST-8 e DAPI per esaminare gli effetti citoprotettivi dell’HW / acqua idrogenata contro l’irradiazione dei raggi UVA. Sei soggetti giapponesi sono stati arruolati in una prova di balneazione HW / acqua idrogenata (DH, 0,2-0,4 ppm) ogni giorno per 3 mesi. I risultati ottenuti hanno mostrato che il bagno HW / acqua idrogenata ha migliorato significativamente le rughe sulla parte posteriore del collo in quattro soggetti il ​​90 ° giorno rispetto al giorno 0. Così è stata raggiunta la conclusione, in cui HW può servire come una routine quotidiana di cura della pelle per reprimere UVA- ha indotto danni alla pelle con il lavaggio del ROS e la promozione della sintesi di collagene di tipo I nel derma. D’altra parte, molti studi di ricerca di base hanno dimostrato che l’HW / acqua idrogenata è ampiamente applicato a varie malattie, come assunzione orale per l’assorbimento attraverso il tratto gastrointestinale [ 9 – 14 ]. Le ricerche suggeriscono ovviamente che sia utilizzando un tipo di bagno che un tipo di trattamento con assunzione orale, l’HW / acqua idrogenata è ancora un metodo efficace per riparare la pelle e eliminare i ROS [15-17].

Abbiamo teorizzato che un trattamento di routine in combinazione con l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF per i pazienti con PU può migliorare la guarigione delle ferite e mantenere una migliore condizione di salute rispetto a prima. Lo scopo di questo studio è di chiarire l’efficacia clinica della guarigione delle ferite per i pazienti con PU mediante l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF. Inoltre, sono state esaminate le cellule OUMS-36 e le cellule HaCaT per analizzare i meccanismi relativi all’idrogeno che svolge un ruolo nella guarigione delle ferite a livello cellulare, in vitro .

metodi

Materiali clinici

pazienti

I dati delle cartelle cliniche che sono stati analizzati per questo studio sono stati ottenuti da ventidue pazienti giapponesi anziani con PU che sono stati ricoverati e istituzionalizzati nell’ospedale di Kobayashi, città di Fukuyama, Prefettura di Hiroshima, in Giappone, che è un ospedale generale collegato a cure miste a lungo termine servizio, struttura. Questo studio è stato approvato dal comitato etico dell’ospedale di Kobayashi.

L’età dei pazienti con PU che abbiamo trattato in questo studio variava da 71,0 a 101,0 (86,7 ± 8,2) anni e dieci pazienti erano donne. Al momento del ricovero, avevano sofferto di una o più malattie e complicazioni e quasi tutti erano anziani costretti a letto ad alto rischio di sviluppo di PU, e tutti non potevano mangiare senza l’aiuto di altre persone. Al momento del ricovero o durante il ricovero, tutti i pazienti presentavano o manifestavano gradualmente sintomi di PU.

I tipi di malattie e complicanze in questi pazienti, non solo includevano disordini alimentari, ma il 90% mostrava anche la prevalenza di essere in età avanzata e il 100% aveva una mobilità ridotta. Tuttavia, va sottolineato che l’incidenza della PU di nuova insorgenza nell’ospedale di Kobayashi è rimasta all’incirca del 2,10% nel 2010-2011, persistendo a un livello basso. Perché è stato riferito che l’incidenza media di PU era del 2,43% in un sondaggio nazionale condotto dalla Japanese Society of Pressure Ulcers [ 18 ].

Ventidue pazienti sono stati raggruppati retrospettivamente in EG (gruppo efficace, n = 12) e LG (gruppo meno efficace, n = 10) in base agli esiti della valutazione dell’endpoint e ai criteri di guarigione. Sono stati riepilogati i dettagli relativi alle dimissioni dall’ospedale per stabilire se la cura o meno e i dati di base (Tabella 1 ). Nell’elaborazione dei dati, i risultati di tutti i pazienti sono stati classificati come stadio I-IV secondo le Linee guida nel 2009 di EPUAP (European Advisory Ulcer Pressure Panel) e NPUAP (National Pressure Ulcer Advisory Panel) che viene utilizzato come valutazione per la gravità della PU. Per coincidenza, tutti i pazienti in questo studio appartenevano allo stadio II o III.

Tabella 1 Caratteristiche dei dati di base dei pazienti PU in due gruppi

Trattamenti di cure cliniche

Cure ospedaliere di routine

Il trattamento si è concentrato sulla prevenzione del peggioramento della PU e sul ripristino di una pelle sana. Secondo i trattamenti di cura di routine per tutti i pazienti, sono state selezionate terapie non chirurgiche, come unguento, garza, avvolgimento e imbottitura del letto dopo il lavaggio mediante la disinfezione con acqua acida. La cura della pelle, la riduzione della pressione e il supporto nutrizionale sono stati utilizzati in modo aggressivo come parte di questo trattamento di cura [ 1 , 3 ]. I principali passaggi di cura per il trattamento della PU includevano:

  1. Gestire il carico tissutale.
  2. Mantenere l’area dell’ulcera pulita e coperta e non lasciarla asciugare.
  3. La posizione del corpo cambia almeno ogni 2 ore se il paziente è confinato in un letto o ogni 15 minuti se seduto su una sedia a rotelle.
  4. Per raggiungere un bilancio nutrizionale azotato positivo, il paziente ha consumato da TF circa 30 a 35 calorie al kg al giorno e da 1,25 a 1,50 g di proteine ​​al kg al giorno.

Preparazione per HW / acqua idrogenata

HW / acqua idrogenata è stato preparato con un apparato gorgogliante di idrogeno che consiste principalmente in una sezione di approvvigionamento idrico per la produzione di RW con meno 0,018 ppm di DH e +184 mV di ORP, e HW con 0,8-1,3 ppm di DH e da −602 mV a −583 mV di ORP. Per confrontare HW / acqua idrogenata con RW, i parametri caratteristici dell’acqua sono stati misurati con i diversi tassi di diluizione (Tabella 2 , Figure 1 e 2 ). Va sottolineato che alcuni indicatori caratteristici stabili e le proprietà dell’innocuità e dell’innocuità dell’acqua di idrogeno sono stati ottenuti da diversi esperimenti separati in vivo e umani che avevamo riportato [ 19 – 23 ]. Nel frattempo, attraverso l’alimentazione tubolare, i pazienti con PU sono stati costretti ad assumere HW / acqua idrogenata di 600 ml al giorno, al mattino e al pomeriggio per circa un’ora, rispettivamente, immediatamente dopo la produzione di HW ogni volta.

Tabella 2 Parametri caratteristici ottenuti dall’acqua disciolta con idrogeno rispetto all’acqua ultra-pura osmotica inversa
Figura 1
Figura 1

Risultati della misurazione della diluizione di HW / acqua idrogenata con RW. I tassi di diluizione sono indicati nella Figura 1 . Le figure 1 – a e – b mostrano le tendenze sempre crescenti su DO (concentrazione di ossigeno disciolto) e ORP (potenziale di riduzione dell’ossidazione). Nel frattempo, come mostrato nelle figure 1 – c e – d , DH (concentrazione di idrogeno disciolto) mostra la tendenza in costante diminuzione che indica che l’idrogeno disciolto nell’acqua di idrogeno è stato evaporato lentamente mescolando con normale acqua normale. D’altra parte, sia HW / acqua idrogenata che RW hanno mantenuto l’intervallo di temperatura di 23,2-24,1 ° C e pH 7,37-7,48 indipendentemente dalla velocità di diluizione da 1 a 11 volte.

figura 2
figura 2

Un apparato per la produzione di acqua disciolta da idrogeno e il confronto tra acqua disciolta da idrogeno e acqua di rubinetto dal punto di vista della loro distribuzione delle particelle di bolle rilevata con un contatore di particelle di aerosol. Figura 2 – a : Il tasso di volume delle bolle di dimensioni indicate rispetto al volume totale di bolle nell’acqua del rubinetto (che si occupa della declorazione) è stato analizzato da un contatore di particelle di aerosol (Beckmann-Coulter, Delsa Nano S). 2- a-1 e a-2 : le particelle di microbolle con diametro superiore a 3 μm nell’acqua del rubinetto erano state occupate nell’istogramma per oltre il 50%. Inoltre, sono stati rilevati cinque parametri di proprietà dell’acqua del campione di acqua di rubinetto come segue. DH: 0,025 ppm, DO: 8,6 ppm, ORP: +250 mV, pH: 7,30, concentrazioni di ioni cloro: 0,015 ppm. 2- b : Le distribuzioni di particelle di bolle nell’acqua disciolta con idrogeno sono state analizzate da un contatore di particelle di aerosol (Beckmann-Coulter, Delsa Nano S). 2- b-1 : particelle nano-gorgoglianti di acqua disciolta con idrogeno erano abbondanti e, al contrario, le particelle di microbolle superiori a 3 μm erano scarse. 2- b-2 : le particelle di nanobolle con diametro inferiore a 1 μm hanno un’occupazione maggiore di una delle particelle di microbolle. 2- c : una vista schematica di un apparato (proposta n. 2005–177724, brevetto giapponese) per la produzione di acqua disciolta con idrogeno. Il meccanismo significa che i volumi minimi di goccioline di dimensioni nane sono prodotti per massimizzare le loro superfici, e quindi un gas idrogeno ad alta pressione è stato fortemente incorporato nelle goccioline all’interno. A proposito, il serbatoio include un ugello di getto e un tubo guida di idrogeno che è stato realizzato dal dispositivo convenzionale. Le parti accessorie principali e i loro indici sono i seguenti: 1. Sezione gas di scarico , 0,01 Mpa; 2. Sezione di approvvigionamento idrico , 0,3 Mpa, 1 lotto = 15 L / 8 min; 3. Sezione di approvvigionamento di gas idrogeno , 0,9 Mpa, 0,55 L / min; 4. Sezione di uscita dell’acqua disciolta con idrogeno ; 5. Particelle minute di porfido di quarzo silice ; 6. Ugello a getto di idrogeno con filtro microporoso , con diametro dei pori di 6,1 μm.

Valutazioni cliniche

Gli indici valutativi per gli effetti terapeutici clinici sulla PU consistevano in giorni ospedalizzati, dimensioni della ferita, classificazioni dello stadio PU e classificazione DESIGN.

Giorni ospedalizzati

Poiché la maggiore durata della degenza ospedaliera è un indice importante per un paziente PU di QOL (qualità della vita), sono stati contati i giorni dall’ammissione alla dimissione per ventidue pazienti.

Dimensione della ferita

Per ottenere informazioni oggettive precise e monitorare il grado di guarigione della ferita, il personale medico ha misurato dimensioni, profondità e area [ 24 ], ha utilizzato fotografie e diagrammi per registrare la forma e il contorno della ferita.

Classificazioni degli stadi PU

Secondo una nota linea guida del panel stabilita da EPUAP e NPUAP nel 2009 [ 3 ], lo stadio II include lo spessore parziale per la perdita di pelle che coinvolge epidermide, derma o entrambi. L’ulcera è superficiale e si presenta clinicamente come un’abrasione o una vescica, ma non è più profonda del derma. D’altra parte, lo stadio III coinvolge l’intera profondità della pelle e può estendersi nello strato di tessuto sottocutaneo che ha un afflusso di sangue relativamente scarso e può essere difficile da guarire [ 25 , 26 ].

PROGETTAZIONE-rating

Il DESIGN è stato uno strumento di valutazione assoluto e utilizzato come indicatore clinico per valutare la qualità delle cure mediche. Ma il suo punteggio non è stato paragonato alla gravità della PU tra i diversi pazienti e le loro varie ulcere. Per questo motivo, il rating DESIGN è stato inventato per essere usato come una valutazione semplice e facile di PU [ 27 , 28 ]. Nel nostro studio, il punteggio di valutazione DESIGN di ogni paziente è stato registrato dal personale medico, almeno una volta al mese.

Esperimenti in vitro

Materiali e metodi

Cellule fibroblastiche dermiche umane normali OUMS-36

Le cellule OUMS-36 sono state coltivate per 18 ore in terreno di Eagle modificato di Dulbecco preparato da HW / acqua idrogenata o RW (DMEM; Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo) integrato con FCS (siero di vitello fetale) al 10% (GIBCO) in un incubatore di CO 2 da conservare a 37 ° C e pH 7,1-7,4 in un’atmosfera umida al 5% di CO 2 . Il mezzo esaurito è stato sostituito dal mezzo di coltura fresco preparato con HW / acqua idrogenata o RW ed è stato immediatamente irradiato con raggi UVA a dosi di 12 o 18 J / cm 2 , corrispondenti al normale intervallo di dose per la vita quotidiana umana. Le cellule risultanti sono state colorate per i nuclei con 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI, terreno di montaggio Ultracruz, sc-24941, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) e osservate per il collagene di tipo I ricostruzione mediante immunostain usando il primo anticorpo diretto contro il collagene di tipo I e l’anticorpo secondario coniugato con FITC (fluoresceina isotiocianato), come osservato con un microscopio a fluorescenza (ECLIPSE E600, Nikon Corp., Tokyo) come precedentemente descritto [ 6 ].

HaCaT normali cheratinociti derivati ​​dall’epidermide umana

Le cellule HaCaT sono state coltivate in modo simile nel DMEM preparato con HW / acqua idrogenata o RW integrato con FCS al 10% (GIBCO) e similmente irradiato con UVA. Le cellule risultanti sono state esaminate per la vitalità cellulare con metodi WST-1 usando (fenil) -5- (2-disulfofenil) -2H-tetrazolio, sale monosodico come indicatore redox e per ROS come i radicali anionici superossido da NBT (nitro blue tetrazorium) come precedentemente descritto [ 6 ].

analisi statistica

O studio clinico o ricerca in vitro , il test t di Student è stato utilizzato per confrontare la differenza di media ± DS tra il gruppo di controllo e i gruppi trattati utilizzando un software Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, Albuquerque, NM, USA) o un pacchetto software SPSS 11.0 (SPSS inc., Chicago, IL, USA) per Windows. Un valore p inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

risultati

I risultati clinici dei trattamenti di routine in combinazione con HW / acqua idrogenata tramite TF

I giorni ospedalizzati e il rating DESIGN di PU

Per i pazienti con PU, i giorni ospedalizzati in EG erano significativamente più brevi rispetto a LG (113,3 giorni contro 155,4 giorni, p <0,05) e il tasso di riduzione della PU era di circa il 28,1% (Figura 3 -a). Allo stesso modo, anche il rating DESIGN in EG è stato diminuito per il confronto dell’insorgenza con l’endpoint (11,5 percentuali contro 14,3 percentuali, p <0,05) tra le valutazioni pre-post, comprese entrambe all’inizio (valutazione nel tempo iniziale, al giorno per il ricovero in ospedale) e in endpoint (valutazione dell’ultima volta, al giorno per la dimissione dall’ospedale o il giorno della morte). In LG, non è stato riscontrato alcun significato statisticamente significativo, nella valutazione DESIGN indicativo del grado di gravità per PU, tra i due (Figura 3 -b).

Figura 3
Figura 3

Confronto degli effetti clinici della PU per i giorni ospedalizzati e il rating DESIGN nel gruppo efficace e nel gruppo meno efficace. Figura 3 – a mostra che il periodo per i giorni ospedalizzati in PU in EG era significativamente più breve rispetto a LG. La Figura 3 – b indica che il rating DESIGN in EG è stato ridotto per confrontare l’insorgenza con l’endpoint. Sono state eseguite valutazioni pre-post, in cui sono stati inclusi l’insorgenza e l’endpoint. Tutti i valori vengono confrontati statisticamente. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t di Student e le differenze significative sono definite come p <0,05. I dati sono presentati come mezzo con la deviazione standard (± SD, indicato dalla barra verticale). p <0,05.

Risultati della dimensione della ferita in due gruppi

La misurazione della ferita è un mezzo importante per conoscere i gradi di PU e il suo metodo di misurazione è stato dimostrato nella Figura 4 -a (Figura 4 -a). Sia in EG che in LG, le variazioni riducenti (EG: 91,4%; LG: 48,6%) delle dimensioni della ferita rappresentano una differenza statisticamente significativa ( p <0,05, p <0,001). Allo stesso modo, si nota anche una differenza significativa tra entrambi i gruppi EG e LG ( p <0,05) (Figura 4 -b).

Figura 4
Figura4

Metodi di misurazione della dimensione della ferita e risultati della dimensione della ferita nella variazione riduttiva della dimensione della ferita tra i due gruppi. Figura 4 – a mostra il metodo di misurazione della ferita. Come protocollo, inizialmente, misurare la lunghezza massima lungo la direzione assiale (dalla testa ai piedi), quindi la larghezza massima lungo la direzione trasversale (da un lato all’altro) usando un righello di centimetro. Moltiplicare infine le distanze di lunghezza e larghezza per ottenere una stima della superficie in centimetri quadrati (cm 2 ). La Figura 4 – b indica una differenza statisticamente significativa alla riduzione della dimensione della ferita in due gruppi. Alcuni pazienti avevano più sedi per la PU. I valori vengono confrontati statisticamente. Test di studente, * p <0,05, *** p <0,001.

Espressione di vari indici di valutazione PU forzando sia lo stadio II che lo stadio III

Per osservare gli effetti clinici sotto molti aspetti, inclusi i giorni ospedalizzati, la classificazione DESIGN e la dimensione della ferita, EG e LG sono stati suddivisi in quattro sottogruppi in base alle classificazioni degli stadi PU (vedere Metodi (3) -3 ). Di conseguenza, nella fase II, un periodo di giorni ospedalizzati in EG ha mostrato significativamente più breve rispetto a LG (87,5 giorni contro 387,0 giorni, p <0,001). Contrariamente a questo, in due gruppi, non vi era alcun significato statistico per i giorni ospedalizzati in stadio III (Figura 5 -a) a causa di malattie diverse dalla PU. Inoltre, in EG, il rating DESIGN ottenuto da sottogruppi di stadio II e stadio III rappresentava una differenza statisticamente significativa ( p <0,05) (Figura 5 -b). Nel frattempo, la riduzione della dimensione della ferita all’interno dei sottogruppi dello stadio II e stadio III presenta eventuali differenze statistiche (Figura 5 -c). In conclusione, le ulcere da stadio II e stadio III di EG sono guarite più velocemente ed efficacemente di quelle di LG.

Figura 5
Figure5

Espressione di vari indici di valutazione PU forzando sia lo stadio II che lo stadio III. Le figure 5 – da a – c implicano differenze molto significative tra quattro sottogruppi basati sullo stadio II o stadio III. Valori P calcolati dal test t di Student, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Risultati di un caso tipico di progresso nella guarigione delle ferite dipendente dal tempo: per una paziente di 85 anni con PU

La Figura 6 mostrava i progressi nella guarigione delle ferite dipendenti dal tempo per una paziente di 85 anni con PU. È stata ricoverata in ospedale per aver sofferto di PU. I reperti delle ferite all’inizio comprendono: posizione: osso sacro; dimensione della ferita (cm 2 ): 20.8; fase: II; Classificazione DESIGN: 16. Quattro mesi dopo il trattamento di routine, più una combinazione con l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF, il cratere è quasi scomparso. I risultati della ferita all’endpoint (rispetto all’insorgenza) includevano: dimensione della ferita (cm 2 ): circa 0 (scomparsa); fase: I (migliorare); Classificazione DESIGN: 6 (diminuzione) (figure da 6 -a a -d).

Figura 6
figure6

Risultati di un caso tipico sullo stato di guarigione della ferita dipendente dal tempo. È stato riportato un progresso annuale in termini di guarigione della ferita dipendente da una paziente con PU di 85 anni. È stata ricoverata in ospedale in cerca di cure per la PU. Figura 6 – a mostra le fotografie dei progressi nella guarigione delle ferite dipendenti dal tempo ottenuti dallo stesso paziente. Le figure da 6 – b a – d rappresentano rispettivamente le diminuite tendenze di dimensioni della ferita, valutazione del DESIGN e stadio.

Risultati di un altro caso tipico di progressi nella guarigione delle ferite dipendenti dal tempo: per un paziente maschio di 80 anni con PU

La Figura 7 mostrava i progressi nella guarigione delle ferite dipendenti dal tempo per un paziente maschio di 80 anni con PU. Il suo periodo di ricovero è durato 10 mesi e potrebbe essere suddiviso in due sotto-periodi. Durante l’ultimo periodo di 5 mesi, ha ricevuto un trattamento HW / acqua idrogenata in aggiunta alle cure di routine. Il risultato mostra un risultato migliorato (Figure 7 -a, -b).

Figura 7
Figure7

Risultati di un altro caso tipico sul progresso della guarigione della ferita dipendente dal tempo. Analogamente alla Figura 6 , la Figura 7 mostra anche un progresso nella guarigione della ferita dipendente dal tempo, per un paziente con PU di 80 anni. Figura 7 – a mostra le caratteristiche fotografate nel precedente periodo per il solo trattamento di routine. D’altra parte, la Figura 7 – b presenta quelli fotografati in quest’ultimo periodo per il trattamento di routine e l’assunzione di HW / acqua idrogenata . Quest’ultimo periodo nell’uso dell’assunzione di HW / acqua idrogenata mostra un marcato risultato migliorato.

Esperimenti in vitro

Effetti promotori sulla ricostruzione del collagene di tipo I, come mostrato dall’immunostain, sui normali fibroblasti cutanei umani OUMS-36 che sono stati irradiati con raggi UVA e quindi somministrati con terreno di coltura preparato con RW o HW / acqua idrogenata , rispettivamente

Per studiare l’effetto ricostruttivo di HW / acqua idrogenata sul collagene di tipo I, abbiamo usato immunostain su cellule OUMS-36 che sono state irradiate con raggi UVA e quindi sono state somministrate con RW o HW in vitro , rispettivamente. Le espressioni rappresentative e i valori dei pixel sono stati tracciati con un software ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). La condensazione nucleare (la cosiddetta picnosi) e la frammentazione (la cosiddetta carioresi) si sono verificate per le cellule OUMS-36 irradiate da UVA in RW, ma si sono appena verificate in HW (Figura 8 ). Il gruppo HW mostra una maggiore proliferazione di cellule con morfologia arrotondata nei fibroblasti e morfologia enorme e più abbondante nel collagene di tipo I rispetto a quelli del gruppo RW.

Figura 8
figura 8

Effetti ricostruttivi di HW / acqua idrogenata nelle cellule OUMS-36 irradiate con UVA. Figure 8 – a , – b : Espressioni distributive di collagene di tipo I con immunostain (verde) nelle cellule OUMS-36 che sono state irradiate con raggi UVA e sono state somministrate con RW o HW / acqua idrogenata , rispettivamente. Figura 8 – b : ogni linea tratteggiata gialla indica regioni ricche di collagene di tipo I. Figura 8 – c : intensità di fluorescenza relativa tracciata con ImageJ per presentare il numero di pixel. Viene mostrata la colorazione di collagene di tipo I su cellule OUMS-36 che sono state irradiate con raggi UVA e che sono state somministrate con RW o HW / acqua idrogenata , rispettivamente. Figura 8 – d : la funzione pseudocolore è stata tracciata usando ImageJ come intensità corrispondente al grado di esposizione al collagene di tipo I per cento cellule (μm 2/100 cellule). Ingrandimento: × 200; barre di scala = 50 μm. Test t di Student, *** p <0,001.

Effetti proliferativi della colorazione nucleo-DAPI su fibroblasti cutanei umani normali irradiati con UVA OUMS-36 che sono stati somministrati con terreno di coltura preparato con RW o HW / acqua idrogenata , rispettivamente

Con la microscopia a fluorescenza, il colorante DAPI può essere eccitato dai raggi UVA. Per esaminare l’effetto ricostruttivo di HW / acqua idrogenata sul collagene di tipo I mediante immunostain, abbiamo anche contrastato i nuclei con un colorante DAPI in cellule OUMS-36 irradiate con UVA per osservare i cambiamenti quando le cellule OUMS-36 sono state somministrate con RW o HW in vitro , rispettivamente . L’espressione rappresentativa e l’intensità di fluorescenza relativa sono state tracciate con ImageJ. L’effetto facilitante sulla condensazione e sulla frammentazione nucleare è stato osservato per le cellule OUMS-36 irradiate con UVA in RW, ma si è verificato pressoché in HW / acqua idrogenata come dimostrato dalla colorazione DAPI come il risultato ottenuto dall’immunostain (Figura 9 ). Attraverso la Figura 9 -c, sono stati chiariti i gradi di colorazione DAPI sulle cellule HaCaT irradiate con raggi UVA e somministrate rispettivamente con RW o HW / acqua idrogenata .

Figura 9
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Caratteristiche della colorazione nucleo-DAPI su cellule HaCaT irradiate con UVA. Figure 9 – a , – b : espressioni distributive della colorazione nucleo-DAPI (blu) nelle cellule HaCaT irradiate con raggi UVA e somministrate rispettivamente con RW o HW / acqua idrogenata . Figure 9 – c , – d : l’intensità di fluorescenza relativa e la funzione pseudocolor per il collagene di tipo I sono state tracciate usando ImageJ. Ingrandimento: × 200; barre di scala = 200 μm. Test t di Student, *** p <0,001.

Quantità di ROS nei normali cheratinociti derivati ​​dall’epidermide HaCaT quantificati dal dosaggio NBT

Nelle cellule HaCaT, le quantità di ROS intracellulari sono state aumentate nel mezzo di coltura preparato con RW con irradiazione UVA in diverse dosi di raggi UVA, ma sono state ripristinate nel mezzo di coltura preparato con HW / acqua idrogenata come mostrato dalla colorazione NBT per i radicali anionici superossido. La morfologia cellulare è stata osservata per essere più salutare e meno dannosa in HW / acqua idrogenata  rispetto a RW (Figura 10 ). La Figura 10 -e ha mostrato che la macchia NBT era più densa di colore blu scuro nelle cellule somministrate RW rispetto alle cellule somministrate HW / acqua idrogenata , indicando la repressione ROS intracellulare nelle cellule somministrate HW / acqua idrogenata .

Figura 10
Figura 10

Quantità ROS intracellulari in cellule HaCaT come quantificate dal dosaggio NBT. Figure 10 – a , – b : la morfologia cellulare trattenuta e il ROS ridotto sono stati mostrati nel mezzo di coltura preparato con HW / acqua idrogenata per il confronto con RW. Le linee tratteggiate gialle indicano abbondanti coloranti blu scuro che sono stati i prodotti di reazione in cui è stato scoperto che ROS come il superossido ossido-radicale reagisce con la colorazione NBT. Figure 10 – c , – d : le espressioni del plotter di superficie di ImageJ. Figura 10 – e : I valori di grigio medio ottenuti da ImageJ utilizzati per esprimere l’aumento o la diminuzione dei radicali anionici superossido all’interno dei normali cheratinociti derivati ​​dall’epidermide HaCaT secondo la colorazione NBT. Nel dettaglio, l’asse verticale mostra la luminosità presentata come un valore di grigio medio, che viene considerato come un indice per mostrare l’intensità della colorazione cellulare e utilizzare per indicare le quantità di ROS. Le morfologie cellulari di RW e HW / acqua idrogenata  sono state divise nelle otto regioni e quindi confrontate con i loro valori di grigio medio dal test t di Student (** p <0,01). Ingrandimento: × 200; barre di scala = 100 μm.

Aumento della vitalità cellulare mediante somministrazione pre-irradiazione con acqua disciolta con idrogeno in cellule HaCaT irradiate con UVA come valutato dal test WST-1 a base di deidrogenasi mitocondriale

Nelle cellule HaCaT, la vitalità cellulare è stata ovviamente aumentata nel mezzo di coltura preparato con HW / acqua idrogenata con irradiazione UVA, rispetto al mezzo di coltura preparato con RW mediante dosaggio WST-1 (Figura 11 -d). La morfologia cellulare è stata anche osservata come meno vulnerabile in termini di diversi sintomi come il restringimento cellulare, la condensazione nucleare e la frammentazione cellulare per HW / acqua idrogenata rispetto a RW (Figure 11 -b, -c). Il gruppo HW ha mostrato una maggiore proliferazione di cellule con morfologia arrotondata e morfologia enorme, nelle cellule HaCaT rispetto a quelle del gruppo RW. Tutte queste evidenze hanno predetto che l’acqua disciolta dall’idrogeno può esercitare effetti citoprotettivi contro i raggi UVA sulle cellule HaCaT.

Figura 11
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Risultati della vitalità cellulare delle cellule HaCaT come valutato dal test WST-1. Figura 11 – a : Le cellule HaCaT sono mostrate nello stato non somministrato o non irradiato con raggi UVA. Figure 11 – b , – c : le caratteristiche morfologiche delle cellule HaCaT sono mostrate rispettivamente in RW o HW, dopo irradiazione con raggi UVA. Figura 11 – d : la vitalità cellulare è mostrata per le cellule HaCaT dopo irradiazione UVA mediante test WST-1. Ingrandimento: × 400; Barra della scala = 100 μm. Test dello studente, ** p <0,01.

Discussione

Lo scopo del presente studio era di esaminare l’efficacia clinica della guarigione delle ferite per PU utilizzando l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF. Abbiamo ipotizzato che il trattamento di routine in combinazione con l’assunzione di HW / acqua idrogenata per i pazienti con PU possa migliorare la guarigione delle ferite e mantenere per loro condizioni più sane. Inoltre, i normali fibroblasti cutanei umani OUMS-36 e i normali cheratinociti derivati ​​dall’epidermide umana HaCaT sono stati esaminati per esplorare i meccanismi alla base del fatto che l’idrogeno svolga un ruolo nella guarigione delle ferite nell’aspetto del tessuto cutaneo, attraverso esperimenti in vitro .

I nostri risultati clinici sembrano suggerire che l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF è un mezzo efficace per la guarigione delle ferite nei pazienti con PU che soffrono di disturbi alimentari. Nonostante i limiti causati dalla pratica del nostro intervento clinico per PU, siamo stati in grado di ottenere i risultati migliori in giorni ospedalizzati, dimensioni della ferita e altri indici clinici confrontando EG con LG. Pertanto, abbiamo stimato che l’HW / acqua idrogenata assorbito dal tratto gastrointestinale svolge un ruolo importante nella riduzione dello stress ossidativo, nella ricostituzione della matrice extracellulare e negli effetti antinfiammatori. Diversi esperimenti hanno supportato le nostre considerazioni come segue.

Inizialmente, è stato dimostrato che l’idrogeno gassoso molecolare (H 2 ) ha un’influenza benefica sul tratto gastrointestinale [ 29 ]. Kajiya et al. ha stabilito un modello murino di malattia infiammatoria intestinale umana (IBD) fornendo ai topi acqua potabile contenente a) 5% destrano solfato di sodio (DSS), b) 5% DSS e H 2 oppure c) H 2 solo ad libitum fino a 7 giorni. Hanno scoperto che al giorno 7, gli esiti patogeni indotti dal DSS, inclusi livelli elevati di IL-12, TNF-α e IL-1- β nella lesione del colon, ecc. Sono stati significativamente soppressi dall’aggiunta di H 2 alla soluzione DSS. Pertanto, si è concluso che l’H 2 può avere un’influenza antinfiammatoria sul tratto gastrointestinale in vivo [ 30 ].

In secondo luogo, Nakashima-Kamimura et al. esaminato se l’acqua potabile contenente l’idrogeno disciolto saturo (HW / acqua idrogenata : 0,8 mM H 2 in acqua) è applicabile esaminando gli effetti dello stress ossidativo, della mortalità e della perdita di peso corporeo nonché della creatinina sierica e dei livelli di azoto ureico nel sangue (BUN) . In esperimenti in vivo , i loro risultati hanno mostrato che l’idrogeno è stato rilevato nel sangue quando l’HW / acqua idrogenata è stato posto tramite gavage a una dose di 15 ml / kg nello stomaco di un ratto, e l’HW / acqua idrogenata è applicabile per alleviare gli effetti collaterali nefrotossici indotti da un anti farmaco antitumorale, come il cisplatino [ 31 ].

In terzo luogo, poiché l’idrogeno gassoso molecolare può agire da spazzino di ROS, Cardinal et al. testato l’effetto del trattamento con HW / acqua idrogenata in un modello di ratto di trapianto di rene. Di conseguenza, il trattamento con HW / acqua idrogenata ha migliorato la funzione di allotrapianto, ha rallentato la progressione della nefropatia cronica da allotrapianto (CAN), ha ridotto il danno ossidativo e la produzione di mediatori infiammatori e ha migliorato la sopravvivenza globale. La loro conclusione è stata che l’HW / acqua idrogenata è un efficace antiossidante e antinfiammatorio in vivo [ 32 ].

In precedenza era stato dimostrato che alcuni radicali liberi inibiscono il processo di guarigione della ferita [ 33 ]. L’H 2 è un gas incolore, inodore, insapore e possiede una certa riducibilità perossidante. L’H 2 è possibile passare facilmente attraverso i villi dell’intestino tenue nel corpo umano all’interno e nel flusso sanguigno [ 15 ], perché il suo peso molecolare è la più piccola di tutte le specie di molecole e ha proprietà gassose ed elettricamente neutre, oltre a mostrare una forte capacità di diffusione. Inoltre, l’H 2 ha forse i suoi canali speciali per il trasporto nello spazio intracellulare, come le acquaporine (AQP) per l’acqua, in particolare l’acqua contenente idrogeno, e le proteine ​​Rhesus (Rh) [ 34 ].

Pertanto, accoppiato con il corpo stesso e la presenza enterogena-H 2 , a causa di specifici batteri intestinali, l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF può svolgere un ruolo importante nel migliorare la formazione di granuli feriti su loci di necrosi disintegrata e la capacità di avere un anti- effetto infiammatorio attraverso un meccanismo di riduzione del ROS.

Inoltre, va sottolineato che le cellule apoptotiche possono stimolare la proliferazione, la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti [ 35 ]. Ci stiamo concentrando su “la proliferazione compensativa indotta dall’apoptosi” che si verifica nella PU [ 36 ]. In generale, la necrosi ha un effetto del danno letale secondario alle cellule circostanti la ferita della PU attraverso il gonfiore e lo scoppio delle cellule. Al contrario, i detriti cellulari causati dalla contrazione cellulare e dalla frammentazione nell’apoptosi in cui la carioresi ( cioè la frammentazione nucleare) e la picnosi ( cioè la condensazione nucleare) vengono rivelati come un evento precoce, sono sottoposti all’endocitosi da entrambi i fagociti migratori professionali ( ad es. Macrofagi e cellule di Langerhans nell’epidermide) e nei fagociti non professionali circostanti. Quindi, si pensa che la “proliferazione compensativa” sia indotta per la ragione che i detriti cellulari vengono gestiti pacificamente per contenere le cellule circostanti con un impatto minimo in peggioramento. In questa occasione, il ROS può essere in grado di essere soppresso dall’acqua di idrogeno per evocare un’apoptosi più delicatamente e, successivamente, l’apoptosi che è causata nelle cellule circostanti le ferite della PU stimola la proliferazione compensativa per portare a una guarigione precoce. In effetti, Cai JM et al. ha riferito che l’inalazione di gas idrogeno al 2% somministrata a un modello di ratto ipossia-ischemia neonatale potrebbe ridurre l’apoptosi [ 37 ].

Quando l’assunzione di HW / acqua idrogenata tramite TF è stata combinata con trattamenti di routine, il processo di guarigione delle ferite può essere notevolmente accelerato. Quindi, il meccanismo efficace di HW / acqua idrogenata possiede almeno due possibili percorsi, in primo luogo è un effetto antiossidante e in secondo luogo è un effetto anti-infiammatorio. Inoltre, abbiamo pensato che l’HW / acqua idrogenata potesse avere effetti aggiuntivi, come la ricostruzione del collagene e la citoprotezione per altre cellule cutanee e epidermiche. Pertanto, abbiamo condotto un esperimento in vitro sui normali fibroblasti cutanei umani OUMS-36 e sui normali cheratinociti derivati ​​dall’epidermide umana HaCaT per esaminare la loro interazione. Pertanto, le cellule cutanee o epidermiche sono state rispettivamente coltivate in terreno preparato con HW / acqua idrogenata o RW. Immunostain è stato usato per osservare la ricostruzione del collagene di tipo I nelle cellule OUMS-36 e ha mostrato l’effetto promotivo. E la vitalità cellulare delle cellule HaCaT è stata esaminata in termini di osservazione morfologica cellulare e test WST-1, e il loro ROS generato, in particolare i radiali di cipolla superossido, è stato misurato dal dosaggio NBT, rispettivamente, tutti i quali hanno mostrato la cellula-morte-repressiva e ROS effetti di salvataggio.

Abbiamo tentato di disegnare le illustrazioni per assumere un meccanismo di cura dallo stadio III alla guarigione della ferita durante la PU (Figura 12 ).

Figura 12
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Meccanismo per la guarigione delle ferite dell’ulcera da pressione con acqua disciolta con idrogeno. Stiamo prevedendo che ROS può portare a un’ulcera da pressione e il processo causativo è mostrato dall’illustrazione a sinistra. Innanzitutto, fattori diversi come la sindrome costretta a letto, la pressione meccanica e l’ischemia locale producono ROS che provoca necrosi e apoptosi in combinazione con altri fattori patologici, causando potentemente ferite e difetti dei tessuti dell’ulcera da pressione. D’altra parte, l’illustrazione giusta mostra il meccanismo di guarigione. L’assunzione orale di acqua di idrogeno a bolle nano attraverso il bere o l’alimentazione del tubo passa dalla bocca o dall’esofago e viene assorbita dalle cellule epiteliali dell’intestino tenue. È possibile che l’idrogeno traspira in passato da / acqua idrogenata HW e inalato dal polmone. Quindi, l’idrogeno assorbito a nanobolle migra verso il tessuto cutaneo attraverso la circolazione sanguigna ed elimina i ROS generati in abbondanza nella PU. Infine, questo processo provoca la ricostruzione del collagene dei fibroblasti nel derma e la proliferazione dei cheratinociti nell’epidermide e provoca angiogenesi e rimodellamento per le riparazioni nel tessuto difettoso.

Di conseguenza, i nostri dati in vitro hanno dimostrato che i ROS intracellulari sono diminuiti di HW / acqua idrogenata , ma non di RW, nei fibroblasti OUMS-36 irradiati con UVA. Si sono verificate condensa e frammentazione nucleare per le cellule OUMS-36 irradiate con UVA in RW, ma si sono appena verificate in HW, come dimostrato dalla colorazione DAPI. Inoltre, nelle cellule HaCaT, la mitocondriale deidrogenasi, in particolare l’attività della deidrogenasi succinata, è stata ridotta nel terreno di coltura preparato con RW con irradiazione UVA, ma è stata trattenuta nel mezzo di coltura preparato con HW, come mostrato dal dosaggio NBT e WST-1. Pertanto, è stato suggerito che i ROS indotti dai raggi UVA, in particolare l’ossigeno singoletto e i radicali di cipolla superossido, vengono eliminati dall’idrogeno e provocano la citoprotezione contro la disfunzione mitocondriale indotta dai ROS.

Risultati simili sono stati riportati da precedenti lavori di ricerca sulla ricostruzione del collagene in altre cellule cutanee o epidermiche da parte di HW [ 38 , 39 ]. Come meccanismo per l’utilizzo di HW per il trattamento della PU nell’aspetto delle cellule cutanee ed epidermiche, riteniamo che ci siano tre vie come segue: (1) la promozione della formazione della struttura del derma e la ricostruzione del collagene di tipo I, (2 ) la prevenzione della formazione di granuli feriti su loci di necrosi disintegrata e (3) la riparazione e il ripristino dei tessuti cicatriziali.

Gli effetti curativi per i pazienti con PU attraverso l’assunzione di HW tramite TF, come dimostrato dal nostro studio attuale, sono stati appena trovati in passato. La nostra esperienza in questo studio ha aggiunto ulteriori prove di un possibile ruolo nelle terapie mediche per la PU. Inoltre, come è noto, esistono diversi metodi per produrre l’acqua di idrogeno da parte di diversi gruppi di ricerca, quindi ci sono anche diversi parametri dell’acqua sull’HW. Al fine di mostrare i nostri dati ottenuti dalle misurazioni con i diversi rapporti di diluizione, abbiamo appositamente impostato le Figure 1 e 2 , nonché la Tabella 2 per presentare questi risultati. Come produrre HW e RW è una questione importante ed essenziale nel campo della medicina dell’acqua all’idrogeno.

Tuttavia, questo studio presenta alcuni limiti che dovrebbero essere considerati nell’interpretazione dei risultati. In primo luogo, il disegno dello studio non può essere eseguito come percorso di controllo randomizzato (RCT), poiché generalmente il test di intervento clinico sulla cura della PU non può essere eseguito come RCT a causa di altri diversi fattori come la concorrenza e le complicanze di varie malattie. La situazione clinica non ci ha permesso di ottenere dati clinici prima di uno come abbiamo progettato. In secondo luogo, non siamo stati in grado di progettare la sperimentazione di confrontare i risultati sia dell’assunzione orale di HW che del lavaggio esterno di siti dannosi con HW, rispettivamente. Questi meritano lo studio del passo successivo.

conclusioni

È stato dimostrato che l’assunzione di HW tramite TF, per pazienti anziani gravemente ricoverati in ospedale con PU, esegue la riduzione della dimensione della ferita e il recupero precoce, entrambi i quali sono potuti derivare dalla costruzione di collagene di tipo I nei fibroblasti cutanei o dalla promozione della riduzione della capacità mitocondriale e della repressione dei ROS in epidermica cheratinociti come mostrato rispettivamente dai test immunostain, NBT e WST-1.

Consenso

Consensi informati scritti che sono stati presentati dai pazienti per la pubblicazione di questo rapporto e qualsiasi immagine di accompagnamento sono stati ottenuti e confermati come autorizzazione etica dal Comitato Etico dell’ospedale di Kobayashi, città di Fukuyama, Prefettura di Hiroshima, Giappone.

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Astratto

Riferimenti Scarica riferimenti

Ringraziamenti

Gli autori sono grati all’ospedale di Kobayashi e al direttore rappresentativo Dr. Yoshizi Kobayashi, per il loro sostegno devoto a parte della sperimentazione clinica. Questo studio è stato supportato, in parte, da una sovvenzione in aiuto da parte del JCAAMS (Centro giapponese per le cure antinvecchiamento di Hiroshima).

Informazioni sull’autore

Corrispondenza a Nobuhiko Miwa .

Informazioni aggiuntive

Interessi conflittuali

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

Contributi degli autori

Ha condotto e progettato gli esperimenti: QL NM. Eseguiti gli esperimenti: DM SK QL. Analizzati i dati: QL NM. Apparecchi / reagenti / materiali forniti: DM HT NM. Ha scritto il manoscritto: QL NM. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

File originali inviati dagli autori per immagini

Di seguito sono riportati i collegamenti ai file originali inviati dagli autori per le immagini.

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