L’acqua idrogenata riduce le risposte infiammatorie e previene l’apoptosi delle cellule del sangue periferico negli adulti sani: uno studio randomizzato, in doppio cieco e controllato

Astratto

Le prove degli effetti benefici del consumo di acqua idrogenata (HW) sono rare. Abbiamo mirato a studiare gli effetti del consumo di acqua idrogenata HW sullo stress ossidativo e sulle funzioni immunitarie in adulti sani utilizzando approcci sistemici di nutrizione biochimica, cellulare e molecolare. In uno studio randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo, adulti sani (20-59 anni) hanno consumato 1,5 L / d di acqua idrogenata HW ( n  = 20) o semplice acqua (PW, n = 18) per 4 settimane. Le variazioni dal basale alla 4a settimana del potenziale antiossidante biologico sierico (BAP), dei derivati ​​dell’ossigeno reattivo e dell’8-Oxo-2′-deossiguanosina non differivano tra i gruppi; tuttavia, in quelli di età ≥ 30 anni, la BAP è aumentata maggiormente nel gruppo acqua idrogenata HW rispetto al gruppo PW. L’apoptosi delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) era significativamente inferiore nel gruppo acqua idrogenata HW. L’analisi mediante citometria a flusso delle cellule CD4 + , CD8 + , CD20 + , CD14 + e CD11b + ha mostrato che la frequenza di CD14 +le cellule sono diminuite nel gruppo acqua idrogenata HW. L’analisi del sequenziamento dell’RNA delle PBMC ha dimostrato che i trascrittomi del gruppo acqua idrogenata HW erano chiaramente distinti da quelli del gruppo PW. In particolare, le reti trascrizionali delle risposte infiammatorie e la segnalazione NF-κB erano significativamente sottoregolate nel gruppo HW. Queste scoperte suggeriscono che l’acqua idrogenata HW aumenta la capacità antiossidante riducendo così le risposte infiammatorie negli adulti sani.

introduzione

Lo stress ossidativo indica uno stato in cui le specie reattive dell’ossigeno (ROS) eccessive sopraffanno la capacità antiossidante biologica, portando all’interruzione dell’omeostasi dei ROS e al danno cellulare 1 . È importante che le cellule mantengano livelli moderati di ROS per svolgere le normali funzioni fisiologiche 2 . Un livello eccessivo di ROS è responsabile del danno ossidativo del DNA e dei lipidi, che può portare alla morte cellulare 3 . Inoltre, lo stress ossidativo può provocare risposte infiammatorie 3 , 4che può aumentare ulteriormente lo stress ossidativo. Di conseguenza, lo stress ossidativo può agire per precipitare l’infiammazione cronica, con condizioni patologiche che innescano vari disturbi tra cui malattie cardiovascolari, sindrome metabolica, disturbi neurodegenerativi e cancro 5 , 6 , 7 , 8 .

Non c’è dubbio che lo stress ossidativo gioca un ruolo centrale nella patogenesi di varie malattie croniche. Di conseguenza, è stato di crescente interesse valutare gli effetti adiuvanti degli agenti antiossidanti negli alimenti sulla prevenzione e l’alleviamento di queste malattie. Recentemente, la Food and Drug Administration degli Stati Uniti ha riconosciuto il gas idrogeno (H 2 ) come additivi alimentari se utilizzato nell’acqua potabile o nelle bevande e ha dichiarato che sono generalmente riconosciuti come sicuri. H 2 può essere un nuovo antiossidante grazie alla sua capacità di eliminare selettivamente ossidanti forti come il radicale idrossile 9 . Nei modelli di lesione da ischemia / riperfusione, H 2 ha prevenuto il danno tissutale e ridotto le dimensioni dell’infarto 10 , 11 , 12. In modelli di ratto di malattie neurodegenerative, comprese le malattie di Parkinson e Alzheimer, la somministrazione di H 2 ha migliorato la funzione di memoria dei ratti e ha ritardato la progressione della malattia 13 , 14 . Alcuni studi clinici hanno anche determinato l’effetto dell’H 2 su diverse malattie tra cui la sindrome metabolica, l’artrite reumatoide, l’epatite B cronica e il morbo di Parkinson 15 , 16 , 17 , 18 .

Nonostante la crescente evidenza che attesta gli effetti benefici dell’H 2 , a nostra conoscenza, pochi studi sono stati condotti su una popolazione sana. Inoltre, l’effetto sistemico della somministrazione di H 2 non è stato chiarito perché la maggior parte degli studi precedenti si è concentrata solo sulla misurazione di marker limitati. Qui, abbiamo voluto studiare gli effetti di H 2 acqua (HW) Consumo -rich in adulti sani attraverso le ampie analisi di capacità antiossidante, sottoinsiemi di cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC) e il loro profilo trascrittoma e per confrontare gli effetti del consumo HW con quelli del consumo di acqua normale (PW).

Risultati

Partecipanti e caratteristiche di base

Il diagramma di flusso dei partecipanti durante lo studio è presentato in Fig.  1 . Un totale di 158 partecipanti sono stati valutati per l’idoneità in base ai criteri di inclusione ed esclusione. 41 partecipanti sono stati ritenuti idonei e sono stati inclusi nello studio. Sono stati assegnati in modo casuale al gruppo PW ( n  = 19) o al gruppo HW ( n  = 22). Su 3 partecipanti che si sono ritirati dallo studio, 1 partecipante nel gruppo PW ha abbandonato prima di iniziare l’intervento e 2 partecipanti nel gruppo HW hanno abbandonato il 4 ° giorno e il 10 ° giorno. Di conseguenza, un totale di 38 partecipanti hanno completato con successo l’intervento di 4 settimane e sono stati inclusi nell’analisi finale ( n  = 18 nel gruppo PW; n = 20 nel gruppo HW) (Fig.  1 ).

Figura 1
Figura 1

Diagramma di flusso dei partecipanti durante lo studio.

Come mostrato nella Tabella 1 , non c’erano differenze statistiche in età, altezza, peso, BMI e assunzione giornaliera di acqua naturale al basale tra i gruppi PW e HW (tutti P  > 0,05).

Tabella 1 Caratteristiche generali dei partecipanti al basale.

Capacità antiossidante e danni ossidativi

Il consumo di quattro settimane sia di acqua naturale che di acqua ricca di idrogeno ha aumentato il potenziale antiossidante biologico del siero (BAP) (Δ = 194,4 ± 315,4 μmol / L, P  <0,05 in PW; Δ = 297,8 ± 274,2 μmol / L, P  <0,001 in HW) (Tabella 2 ). Sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa nel confronto tra i gruppi di PW rispetto a HW nella popolazione totale ( P  = 0,267) (Tabella 2 ), i partecipanti che avevano più di 30 anni hanno mostrato un aumento significativo di BAP bevendo acqua ricca di idrogeno ma non semplice acqua, e la differenza nei cambiamenti era significativa ( P  = 0,028) (Fig.  2). Al contrario, non è stato riscontrato alcun effetto significativo dell’acqua ricca di idrogeno sulla BAP nel gruppo più giovane (<30 anni) ( P  = 0,534) (Fig.  2 ).

Tabella 2 Capacità antiossidante e marker di danno ossidativo.
figura 2
figura 2

Variazioni rispetto al basale della BAP sierica in base all’età (<30 anni e ≥ 30 anni). I dati sono presentati come medie ± SEM. Differenze significative tra il basale e la settimana 4 all’interno di ciascun gruppo sono state determinate con l’uso di un test t appaiato . I valori di P sono stati ottenuti con l’uso di una semplice analisi degli effetti principali e P  <0,05 è stato considerato statisticamente significativo. ( A ) All’interno dei partecipanti di età <30 anni, non vi era alcuna differenza significativa tra il gruppo PW ( n  = 10) e il gruppo HW ( n  = 10) per la variazione di BAP ( P  = 0,534). ( B ) Il gruppo HW di età ≥ 30 anni ( n  = 10) ha mostrato un aumento maggiore di BAP rispetto al gruppo PW di età ≥ 30 anni (n  = 8) ( P  = 0,028). PW, acqua naturale; HW, H 2 acqua ricchi di; BAP, potenziale antiossidante biologico.

Lo stress ossidativo nel siero valutato dal livello dei derivati ​​dell’ossigeno reattivo (d-ROM) non è stato influenzato dall’intervento di 4 settimane (tutti P  > 0,05) (Tabella 2 ). I livelli di 8-Oxo-2′-deossiguanosina (8-OHdG), un marker per il danno al DNA, sono diminuiti significativamente in entrambi i gruppi (Δ = – 0,94 ± 1,44 ng / mL, P  <0,05 in PW; Δ = – 1,32 ± 1,05 ng / mL, P  <0,001 in HW), ma senza differenze statistiche tra i gruppi PW e HW (tutti P  > 0,05) (Tabella 2 ).

Apoptosi delle PBMC e profili di popolazione di cellule immunitarie del sangue

All’inizio, non c’era alcuna differenza significativa tra due gruppi nelle frequenze delle cellule apoptotiche nel sangue ( P  = 0,606) (Fig.  3 ). Dopo la 4 settimana di prova, tuttavia, il gruppo HW ha mostrato una percentuale significativamente inferiore di apoptosi PBMC rispetto al gruppo PW ( P  = 0,036) (Fig.  3 ).

Figura 3
figure3

Dati rappresentativi della citometria a flusso ( A ) e frequenze delle cellule apoptotiche (annessina V + DAPI + ) al basale e alla settimana 4 ( B ). I dati sono presentati come medie ± SEM. Le differenze significative tra il gruppo PW ( n  = 14) e il gruppo HW ( n  = 15) al basale sono state determinate con l’uso di un test t spaiato o di un test U di Mann-Whitney , e quelle alla settimana 4 sono state determinate con un modello lineare generale aggiustamento per il valore al basale come covariata. PW, acqua naturale; HW, H 2 – acqua ricca.

I sottoinsiemi di PBMC sono stati profilati con gli anticorpi specifici per i marcatori di superficie cellulare inclusi CD4, CD8, CD20, CD14 e CD11b. I gruppi PW e HW hanno presentato modelli simili di cambiamento in CD4 + (Δ = – 3,5 ± 4,8%, P  <0,01 in PW; Δ = – 2,4 ± 3,6%, P  <0,01 in HW), CD8 + (Δ = – 4,8 ± 2,1%, P  <0,001 in PW; Δ = – 4,5 ± 2,6%, P  <0,001 in HW) e cellule CD11b + (entrambe P  > 0,05) (Tabella 3 ). Sebbene la frequenza delle cellule CD20 + sia aumentata nel gruppo HW rispetto ai valori basali (Δ = 1,5 ± 2,5% e P <0,05), non c’erano differenze significative tra i gruppi HW e PW ( P  = 0,900) (Tabella 3 ). È da notare che il cambiamento nella frequenza delle cellule CD14 + nel gruppo HW era significativamente diverso dal cambiamento nel gruppo PW ( P  = 0,039) (Tabella 3 ) .

Tabella 3 Percentuali di sottogruppi di cellule immunitarie del sangue periferico.

Profili trascrittomi di PBMC

Al fine di chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali il consumo di acqua ricca di idrogeno influisce sull’apoptosi e sui profili delle cellule immunitarie delle PBMC, l’analisi del sequenziamento dell’RNA su scala genomica è stata effettuata utilizzando set totali di RNA da 6 individui che includevano tre campioni selezionati casualmente per gruppo. Un totale di 605 geni differenzialmente espressi (DEG) tra i gruppi HW e PW sono stati identificati come descritto in ” Metodi “. Analisi clustering gerarchico mostrato trascrittomi di HW erano facilmente distinguibili da quelle di PW (Fig.  4UN). Per ottenere informazioni sulle implicazioni funzionali dei profili di espressione genica alterati causati dall’acqua idrogenata, i DEG sono stati classificati in base a funzioni fisiologiche e un significato dell’arricchimento di ciascuna categoria è stato testato dal test esatto di Fisher. È interessante notare che i primi 5 categorie significativi erano la risposta infiammatoria, traffico di cellule immunitarie, lo sviluppo del sistema ematologica e la funzione e le malattie infettive e malattie immunologiche (Fig.  4B). All’interno della categoria più significativa, la risposta infiammatoria, era interessante il fatto che i geni coinvolti nella segnalazione TLR-NF-κB fossero notevolmente ridotti nell’espressione. Includevano una serie di recettori simili a pedaggi e molecole mediatori chiave come TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 e MYD88. Inoltre, la trascrizione delle proteine ​​intracellulari coinvolte nella segnalazione di NF-κB inclusi NFKB1, NLRP12 e MAP3K1 e, quindi, i geni a valle come FOS e RELB erano significativamente ridotti nel gruppo HW (Fig.  4 C). Inoltre, abbiamo studiato i livelli di espressione dei geni che rispondono all’attivazione di NF-κB e quelli che codificano le citochine pro-infiammatorie e i loro recettori. Di conseguenza, abbiamo osservato che il gruppo HW aveva livelli di espressione significativamente più bassi in IL1B, IL8, IL6R e TNFRSF10B rispetto al gruppo PW (Fig. 4 D).

Figura 4
figure4

Profili trascrittomi di cellule mononucleate del sangue periferico alla settimana 4. ( A ) Analisi gerarchica di clustering di DEG ( B ) Le 5 principali categorie funzionali biologiche sono state scoperte all’interno di DEG da IPA. La significatività statistica è stata calcolata dal test esatto di Fisher e annotata come log (valore P ). ( C ) Mappe termiche dei livelli di espressione dei geni chiave correlati al recettore toll like e alla segnalazione NF-κB ( D ) Il gruppo HW ( n  = 3) ha presentato i livelli di espressione inferiori nei geni responsivi a IL6R e NF-κB inclusi IL1B, IL8 e TNFRSF10B , rispetto al gruppo PW ( n = 3). I dati sono presentati come medie ± SEM. Differenze significative tra i gruppi PW e HW sono state determinate con l’uso di un test t spaiato . PW, acqua naturale; HW, H 2 acqua ricchi di; DEG, geni differenzialmente espressi; IPA, Ingenuity Pathway Analysis; RPKM, letture per kilobase milioni.

Discussione

Gli effetti dell’acqua ricca di H 2 sul sistema antiossidante sono stati testati in gran parte all’interno di modelli in vitro o animali, con dati umani limitati da pochi studi su pazienti che consentono di dimostrare il ruolo benefico dell’acqua 19 , 20 , 21 . Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo studio clinico randomizzato che studia le attività antiossidanti dell’acqua H 2 in soggetti sani, in particolare attraverso un’analisi completa dei marcatori di stress ossidativo, dei profili delle cellule immunitarie del sangue e dell’espressione genica su scala genomica. Il consumo di quattro settimane di H 2-acqua indotto un sostanziale aumento della capacità antiossidante e una diminuzione dello stress ossidativo del DNA, anche se non c’era alcun significato trovato nel confronto di un intervento (H 2 -acqua) e il gruppo (acqua di rubinetto) placebo. Queste osservazioni secondo cui l’ acqua H 2 mostrava un potenziale di attività antiossidante, ci ha spinto a esaminare ulteriormente l’effetto sull’apoptosi delle cellule del sangue periferico in ciascun soggetto, poiché anche piccoli cambiamenti nello stress ossidativo potrebbero essere sufficienti per avviare il processo apoptotico. Abbiamo scoperto che le frequenze di cellule apoptotiche sono stati significativamente ridotti da H 2 -acqua. Inoltre, l’analisi mediante citometria a flusso del sangue periferico ha mostrato che H 2-acqua ha ridotto significativamente le frequenze delle cellule CD14 + circolanti . È interessante notare che le analisi di sequenziamento dell’RNA hanno identificato una rete trascrizionale di risposta infiammatoria come la funzione biologica più significativa modulata dall’acqua H 2 . Ha soppresso notevolmente le espressioni dei geni coinvolti nella segnalazione TLR-NF-κB, di conseguenza, i livelli di trascrizione delle citochine pro-infiammatorie erano significativamente diminuiti.

Esistono ampie prove sperimentali che lo stress ossidativo può interrompere la funzione cellulare deformando gli acidi nucleici 22 ; il danno ossidativo al DNA può essere citotossico o mutageno ed è stato correlato alla patogenesi della malattia 23 . Una delle forme più predominanti di lesione del DNA endogeno è l’8-OHdG, che si forma per aggiunta di radicale idrossile alla deossiguanosina 24 . Pertanto, l’8-OHdG è stato ampiamente utilizzato come segno distintivo dello stress ossidativo e livelli elevati di 8-OHdG potrebbero essere un fattore di rischio per cancro, aterosclerosi e diabetici 25. È interessante notare che la concentrazione di 8-OHdG è scesa al 35% dei livelli basali nel gruppo HW, sebbene non sia stata trovata alcuna significatività a causa della riduzione del 52% anche nel gruppo PW. Ishibashi et al . hanno anche osservato che i pazienti con artrite reumatoide hanno mostrato una significativa riduzione dei livelli di 8-OHdG urinario dopo l’assunzione di 530 ml / die di acqua H 2 per 4 settimane 17 . È stato dimostrato che l’idrogeno-acqua riduce l’ossidazione del DNA in studi su modelli animali. Il trattamento con acqua ricca di H 2 per i ratti ha inibito un aumento dipendente dall’età dei livelli sierici di 8-OHdG 26 . L’effetto protettivo di H 2contro il danno ossidativo del DNA è stato migliorato anche in un modello di coniglio di osteonecrosi indotta da steroidi, come rivelato dalla quantificazione di cellule ematopoietiche 8-OHdG-positive 27 . Allo stesso modo, un’iniezione intraperitoneale di soluzione salina ricca di H 2 nei ratti è stata efficace nel ridurre il numero di cellule miocardiche positive all’8-OHdG dopo aver indotto un danno cardiaco I / R 28 . Una possibile spiegazione meccanicistica per l’effetto soppressivo di HW sulla produzione di 8-OHdG è che l’idrogeno inerte reagisce con il radicale idrossile 9 . Tuttavia, sono necessari ulteriori studi meccanicistici per identificare se esiste un’interazione diretta tra il radicale idrossile e l’idrogeno quando l’idrogeno molecolare viene somministrato tramite l’ingestione orale di H 2-acqua ricca. A differenza dell’8-OHdG, molte molecole diverse sono coinvolte nella perossidazione lipidica, inclusi perossi, alcossi, radicali alchilici, ozono e anidride solforosa, nonché il radicale idrossile 23 . È noto che H 2 rimuove selettivamente i radicali idrossilici senza influenzare altri ROS 29 ; quindi, non sorprende che durante l’intervento non siano stati osservati cambiamenti nei d-ROM.

L’invecchiamento è generalmente caratterizzato da uno stato in cui lo stress ossidativo sistemico è elevato e / o il sistema di difesa antiossidante è alterato, indicando una disregolazione dell’equilibrio redox e l’accumulo di danni ossidativi 30 . Abbiamo quindi ipotizzato che gli effetti dell’acqua H 2 potessero variare con l’età dei partecipanti. Sebbene non vi fosse alcuna differenza nel potenziale antiossidante biologico sierico tra i gruppi di intervento e placebo nella popolazione nel suo insieme, la stratificazione per età ha mostrato un aumento significativo della capacità antiossidante nel gruppo più anziano di età ≥ 30 anni. Il gruppo di età più giovane (<30 anni) non ha mostrato differenze tra i gruppi H 2- acqua e placebo. Questo risultato implica che H 2-acqua potrebbe esercitare più benefici sulla capacità antiossidante negli anziani che nei giovani.

L’apoptosi è una delle conseguenze derivanti dall’eccessiva generazione di ROS 31 . Come catena respiratoria mitocondriale è la principale fonte di ROS endogeni, DNA mitocondriale, proteine e lipidi sono suscettibili all’attacco ROS, e questi danni biomolecolari oltre la capacità di riparazione possono portare alla morte cellulare programmata 32 . L’eccessiva distruzione delle cellule normali costituisce una delle principali cause di invecchiamento 33 , diabete 34 e malattie neurodegenerative 35. Sorprendentemente, il gruppo HW ha mostrato una percentuale inferiore di PBMC apoptotiche alla settimana 4 rispetto al gruppo PW. Ciò ha suggerito che il consumo di HW era efficace nel prevenire gravi danni cellulari. Poiché le molecole di idrogeno hanno dimensioni ridotte e un peso molecolare basso abbastanza da diffondersi attraverso la membrana cellulare ed entrare nei compartimenti intracellulari, l’H 2 potrebbe aver soppresso direttamente questi gravi danni 36 . La funzione anti-apoptotica di H 2 è stata segnalata da altri in studi su modelli animali come ratti indotti da ischemia / riperfusione 37 e ratti ipossia-ischemia 38. Inoltre, uno studio sull’uomo di uno studio clinico non controllato in pazienti con potenziale sindrome metabolica ha dimostrato un effetto anti-apoptotico del consumo di HW nelle cellule endoteliali 16 . La diminuzione dell’apoptosi nel presente studio potrebbe essere stata collegata alla diminuzione della frequenza delle PBMC CD14 positive. Il CD14 è espresso principalmente sulla superficie dei monociti circolanti umani 39 . Le cellule sottoposte a stress ossidativo inducono i monociti CD14 + a migrare intorno a loro per la clearance delle cellule apoptotiche 40 e i monociti reclutati fagocitano con successo le cellule morenti 41 . Pertanto, l’attenuazione dello stress ossidativo ha determinato una diminuzione del danno cellulare, che, a sua volta, ha ridotto la frequenza dei monociti circolanti.

Lo stress ossidativo e l’infiammazione sono strettamente collegati tra loro. Le cellule immunitarie sono stimolate dalle biomolecole danneggiate dai ROS per promuovere una risposta infiammatoria 3 , 4 . Alcuni ROS attivano direttamente proteine ​​redox sensibili e fattori di trascrizione tra cui la protein chinasi attivata da mitogeno (MAPK) e NF-κB. Inoltre innescano la produzione di citochine pro-infiammatorie tra cui IL-1 e IL-6 42 , 43 . Le cellule infiammatorie generano ROS, migliorando così ulteriormente queste risposte. I radicali idrossilici agiscono come un forte messaggero per l’attivazione di NF-KB, che è fondamentale nell’infiammazione, di conseguenza, l’eliminazione dei radicali contribuisce agli effetti antinfiammatori 44 . Come mostrato nel presente studio, H 2-consumo di acqua notevolmente down-regolato il percorso di segnalazione NF-κB. H 2 ha anche soppresso i geni regolati da NF-κB nel fegato di topo sano 45 . In studi su animali con modelli di infiammazione, la somministrazione di H 2 ha ridotto efficacemente i livelli di citochine pro-infiammatorie come IL-1, IL-6 e TNF-α 46 , 47 , 48 , 49 . Inoltre, è stato riportato che H 2 genera fosfolipidi modificati, un antagonista dei fosfolipidi ossidati, con conseguente diminuzione della segnalazione di Ca 2+ e Ca 2+-fattore nucleare dipendente della via dei linfociti T attivati ​​(NFAT) che induce la produzione di citochine pro-infiammatorie 50 .

Nel presente studio, 1,5 L di acqua sono stati consumati quotidianamente da tutti i partecipanti sia che si trovassero nel gruppo di intervento che nel gruppo placebo. Sulla base delle auto-registrazioni di un individuo sull’assunzione abituale di acqua che è stata analizzata prima della partecipazione, questo studio di intervento ha spinto i partecipanti a bere in media 300 ml di acqua in più rispetto al loro consumo abituale. Pertanto, questo aumento dell’assunzione di acqua potrebbe generare effetti benefici sulla fisiologia del sistema immunitario, che potrebbero essere attribuiti all’osservazione che la capacità antiossidante biologica è stata migliorata e il danno ossidativo al DNA è stato ridotto anche dall’acqua normale. Alcuni limiti dello studio includono un intervento a breve termine e quindi i risultati non possono affrontare l’effetto a lungo termine dell’H 2-acqua. Inoltre, i partecipanti allo studio sono stati reclutati principalmente dalla Seoul National University e residenti locali, e quindi potrebbero non essere rappresentativi della popolazione generale di adulti sani. Infine, il numero della popolazione in studio potrebbe non essere stato abbastanza grande da produrre una differenza significativa nei marcatori di stress ossidativo nel sangue.

In conclusione, questo lavoro presenta, a nostra conoscenza, il primo studio completo in doppio cieco controllato con placebo che studia gli effetti dell’acqua H 2 negli adulti sani. 1,5 L di assunzione di acqua H 2 per 4 settimane hanno ridotto la morte cellulare e le risposte infiammatorie modulando le reti trascrizionali della segnalazione TLR-NFκB. Inoltre, può promuovere la capacità antiossidante biologica per gli adulti> 30 anni in più rispetto agli individui più giovani.

Metodi

Partecipanti

158 persone sono state reclutate per lo studio che è stato pubblicizzato sul sito web del portale della scuola e sulle bacheche. Sono stati valutati per l’idoneità in base ai seguenti criteri di inclusione: uomini e donne di età compresa tra 20 e 59 anni; nessuna storia medica di malattie acute o croniche; e consumo medio giornaliero di acqua compreso tra 500 e 2.500 ml. I criteri di esclusione erano i seguenti: consumo di bevande inclusi caffè, tè, bibite e alcol> 500 ml al giorno; consumo di bevande alcoliche> 2 giorni a settimana; uso regolare di integratori antiossidanti inclusi vitamine e minerali negli ultimi 3 mesi; abitudini di fumo o di intenso esercizio fisico. Un totale di 117 volontari sono stati esclusi in base ai seguenti motivi: 36 persone non corrispondevano al nostro standard di consumo di acqua pura (500–2.500 ml / giorno);35 persone stavano consumando bevande extra (non acqua pura) oltre 500 ml / giorno; 29 persone avevano una storia di uso regolare di integratori antiossidanti negli ultimi 3 mesi; 7 persone avevano l’abitudine di fumare; e 17 persone avevano un alto livello di attività fisica secondo l’International Physical Activity Questionnaire.

Progettazione dello studio

Questo studio è stato uno studio di 4 settimane, progettato in parallelo, randomizzato, in doppio cieco e controllato con placebo. I partecipanti idonei sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo acqua normale (gruppo PW) o un gruppo H 2-gruppo con acqua ricca (gruppo HW) e l’assegnazione casuale è stata stratificata per sesso ed età (<30 anni e ≥ 30 anni) con l’uso di un servizio di randomizzazione online (Sealed Envelope, Londra, Regno Unito). All’inizio e dopo la prova, i campioni di sangue sono stati raccolti quando i partecipanti erano a riposo. Ai partecipanti sia nel braccio PW che in quello HW è stato consigliato di mantenere la dieta e le attività fisiche abituali e di evitare di assumere integratori antiossidanti durante il periodo sperimentale. Tutti gli investigatori e il personale coinvolti nell’assegnazione casuale, nella misurazione e nella valutazione dei risultati erano all’oscuro dell’assegnazione. Questo studio è stato condotto presso il Dipartimento di alimentazione e nutrizione della Seoul National University tra agosto e ottobre 2016 ed è stato approvato dall’Institutional Review Board della Seoul National University (IRB n. 1606 / 001-012).Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Questo studio è stato registrato presso il Clinical Research Information Service (CRIS) il 12 aprile 2019 (registro n. KCT0003763). Il consenso informato scritto è stato fornito da tutti i partecipanti prima dell’inclusione nello studio.

Intervento idrico

Sono state utilizzate acqua ricca di H 2 disponibile in commercio (Koreahydrogenwater Corp., Seoul, Korea) e acqua naturale (Coway Co., Ltd, Seoul, Korea). La concentrazione di idrogeno del H 2 ricchi di acqua era 0,753 ± 0,012 mg / L quando misurata usando l’disciolto H 2 analizzatore (Orbisphere 3.654 analizzatore portatile; Hach, Svizzera, Ginevra). Un’etichetta è stata attaccata a ciascun contenitore e su di essa sono state fornite solo informazioni, come il codice del partecipante e la data di produzione. Ad ogni partecipante sono state fornite giornalmente 3 bottiglie di 500 ml di acqua, PW o HW. Tutti i partecipanti sono stati istruiti a terminare i 500 ml di bottiglia d’acqua entro un’ora dall’apertura della bottiglia per ridurre al minimo la perdita di H 2 disciolta. Non erano autorizzati a bere altra acqua aggiuntiva ad eccezione di caffè, tè, bevande analcoliche e bevande alcoliche, ma il consumo totale di tali bevande extra era controllato a ≤ 500 ml al giorno per ridurre al minimo la variazione nel consumo totale di bevande. I partecipanti sono stati incoraggiati a registrare una cronologia quotidiana del consumo di acqua e di eventuali bevande extra se mai consumate. I record sono stati esaminati 2 volte a settimana per migliorare la loro conformità allo studio. La conformità media (%) per il gruppo HW e il gruppo PW erano 99,2 ± 1,7 e 99,3 ± 1,1, rispettivamente, senza differenze statistiche tra i due gruppi ( P  = 0,762), come determinato da Mann-Whitney Utest. L’analisi del consumo di bevande extra non ha mostrato differenze statistiche tra i due gruppi (gruppo HW: 159,0 ± 82,0 ml / giorno; gruppo PW: 143,0 ± 60,1 ml / giorno; P  = 0,090, da un test t spaiato ).

Prelievo di sangue

La prima visita è avvenuta il giorno prima dell’inizio dell’intervento e la seconda il giorno successivo all’ultimo giorno dell’intervento. Ad ogni visita, i partecipanti hanno compilato un questionario contenente le domande sull’assunzione alimentare giornaliera e sulle attività fisiche. I campioni di sangue venoso a digiuno dalla fossa antecubitale sono stati raccolti in provette separatrici di siero da 8 ml (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), provette contenenti EDTA da 8 ml (BD Biosciences) e provette per la preparazione di cellule mononucleate BD vacutainer con citrato di sodio (BD Biosciences). Al momento della raccolta, i campioni di plasma e siero sono stati aliquotati in provette ep da 1,5 mL (Eppendorf, Amburgo, Germania) e congelati a – 80 ° C per un’analisi successiva.

Misurazioni

  • Capacità antiossidante e danni ossidativiLa capacità antiossidante è stata determinata misurando la BAP nel siero utilizzando un test BAP (BAP Kit; Diacron Srl., Grosseto, Italia). Lo stress ossidativo nel siero è stato valutato dal livello di idroperossidi derivati ​​da ROS misurato utilizzando un kit di metaboliti reattivi dell’ossigeno diacron (Diacron Srl.). L’8-OHdG, un indicatore del danno al DNA da stress ossidativo, è stato misurato nel siero con l’uso di un test di immunoassorbimento legato all’enzima (8-OHdG Check ELISA; Jaica, Fukuroi, Giappone) secondo le istruzioni del produttore.
  • Apoptosi delle PBMCLa colorazione dell’annessina V è stata eseguita utilizzando l’anticorpo anti-annessina V coniugato con PE (eBioscience) in tampone di legame dell’annessina V (HEPES 10 mM [pH7.4], NaCl 140 mM. CaCl 2 2,5 mM ) a RT per 15 min. La colorazione DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindolo; Sigma-Aldrich) è stata utilizzata per escludere le cellule morte e l’analisi apoptotica. Le frequenze delle cellule apoptotiche sono state analizzate utilizzando BD LSRFortessa (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
  • Profili di popolazione di cellule immunitarieLe PBMC sono state isolate dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando mezzi a gradiente di densità Ficoll-Paque PLUS (GE healthcare, Songdo, Korea). Le PBMC sono state colorate con CD4 anti-umano coniugato con Alexa Fluor 488 (OKT4; eBioscience, San Diego, CA, USA), CD8 anti-umano coniugato con PE (3B5; eBioscience), CD20 anti-umano coniugato con APC-Cy7 (B -Ly-1; eBioscience), anticorpi anti-CD11b umani coniugati con APC-Cy7 (ICRF44; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anticorpi anti-CD14 umani coniugati con APC (61D3; eBioscience) in tampone FACS (0,1% siero di vitello bovino e sodio azide allo 0,05% in 1 × PBS [soluzione salina tamponata con fosfato]) a 4 ° C per 30 min. I profili di ciascuna popolazione sono stati analizzati mediante citometria a flusso con il software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR, USA).
  • Profili di trascrittoma del sequenziamento di PBMC-RNA di nuova generazioneLe PBMC sono state isolate immediatamente dopo la raccolta del sangue con l’uso di provette per la preparazione di cellule mononucleate BD vacutainer con citrato di sodio (BD Biosciences) e quindi l’RNA totale è stato estratto dalle PBMC (RNAqueous-4PCR Kit; Ambion, TX, USA). La qualità e la concentrazione dell’RNA totale estratto sono state valutate utilizzando Agilent 2.100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA). Dei campioni con un numero di integrità dell’RNA (RIN) maggiore di 8, un totale di 6 campioni (3 campioni per gruppo) sono stati selezionati in modo casuale per essere sequenziati. Successivamente, mRNA intatto è stato catturato dall’RNA totale con l’uso di Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit (Ambion). I campioni totali di mRNA erano esauriti delle subunità ribosomiali 5S, 5.8S, 18S e 28S fino al 99,9% utilizzando RiboMinus Eukaryote System v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).L’assenza di picchi ribosomiali è stata confermata utilizzando Bioanalyzer e RNA 6.000 Pico Kit (Agilent Technologies). Le librerie di cDNA con codice a barre sono state preparate dai campioni di mRNA ribo-impoverito e costruite con l’uso di reagenti in Ion Total-RNA Seq Kit v2 (Life Technologies). Innanzitutto, l’mRNA è stato frammentato con RNasi III a 37 ° C per 3 min. L’RNA frammentato è stato purificato su sfere leganti l’acido nucleico e ibridato con Ion Adapter Mix v2. Successivamente, la legatura è stata eseguita a 30 ° C per 1 h. Le librerie ligate dall’adattatore sono state preincubate con un primer di trascrizione inversa a 70 ° C per 10 min e quindi convertite in cDNA mediante trascrizione inversa a 42 ° C per 30 min. Le librerie di cDNA sono state purificate su sfere leganti gli acidi nucleici e quindi amplificate mediante PCR utilizzando primer con codice a barre (Ion Xpress RNA-Seq Barcode 01-16 Kit; Life Technologies).Dopo la purificazione delle sfere, la molarità della libreria finale è stata determinata utilizzando Bioanalyzer e High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies). Tutte le librerie del trascrittoma sono state diluite a 100 pM utilizzando Bioanalyzer e amplificate su Ion Sphere Particles (ISP) mediante PCR in emulsione con l’uso del sistema Ion One Touch 2 (Life Technologies) e Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit (Life Technologies). L’arricchimento degli ISP positivi allo stampo è stato eseguito utilizzando Ion OneTouch Enrichment System (ES) (Life Technologies) in cui le sequenze di adattatori biotinilati sono state selezionate legandosi alle sfere di streptavidina. Successivamente, gli ISP positivi al modello sono stati sequenziati con l’uso del kit Ion PI Hi-Q Sequencing 200 (Life Technologies). I primer di sequenziamento sono stati ricotti sui frammenti del modello attaccati agli ISP,ei campioni di ISP positivi al modello sono stati caricati su un chip di Ion PI Chip Kit v3 (Life Technologies) e incubati con polimerasi. Infine, il chip è stato posizionato su Ion Proton System (Life Technologies) per il sequenziamento lavorando sul principio che il rilascio di ioni idrogeno veniva rilevato quando nuovi nucleotidi venivano incorporati nel modello di DNA in crescita51 . Tutte le procedure sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore.
  • Analisi bioinformatica di sequenze di RNALe letture grezze generate dal sequencer sono state tagliate e filtrate. Il taglio è stato eseguito per rimuovere la sequenza dell’adattatore e le estremità da 3 ′ di qualità inferiore con punteggi di qualità bassi. Il filtraggio di lettura è stato eseguito per rimuovere i dimeri dell’adattatore, le letture prive di una chiave di sequenziamento e le letture policlonali. Le letture di alta qualità sono state mappate e allineate con la pipeline di calcolo di Bowtie 2 e TopHat 52 . Dopo la mappatura e l’allineamento, i file BAM risultanti sono stati importati nella Partek Genomics Suite v6.6 (Partek Inc., Saint Louis, MI, USA) e convertiti in livelli di trascrizione genica come letture per kilobase di esone per milione di letture mappate (RPKM) con l’uso di un approccio modello misto. Degs sono stati identificati con una soglia piega-cambio (superiore a 2 o inferiore – 2) e P value ( P <0,01). I geni che hanno superato i nostri criteri statistici sono stati analizzati con il software bioinformatico Ingenuity Pathway Analysis (IPA; www.ingenuity.com ). Sono state eseguite analisi di clustering gerarchico e analisi di classificazione biologica. Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per testare un significato per l’arricchimento di specifici processi biologici nell’insieme di DEG.

analisi statistica

L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando la versione 23 di SPSS per Macintosh (IBM Corp., Chicago, IL, USA). Una dimensione del campione è stata calcolata sulla base di uno studio precedente 17 con un α = 0,05 e una potenza dell’80%. Tutti i dati sono stati testati per la normalità prima di selezionare il metodo statistico appropriato. Le caratteristiche generali al basale sono state analizzate sulla base di un test t non appaiato o del test U di Mann-Whitney per identificare se c’erano differenze statistiche tra i gruppi. Una t accoppiatao un test dei ranghi con segno di Wilcoxon è stato utilizzato per i confronti all’interno del gruppo tra il basale e la settimana 4. Le variazioni dal basale alla settimana 4 sono state confrontate tra i gruppi PW e HW sulla base di un modello lineare generale con un aggiustamento per il valore a basale come covariata. Abbiamo condotto un’ANOVA a due vie con un aggiustamento per il valore al basale come covariata per determinare l’interazione tra gli effetti del trattamento (PW o HW) e l’età (<30 anni o ≥ 30 anni) riguardo alle variazioni dal basale alla settimana 4 in BAP, d-ROM, 8-OHdG, apoptosi PBMC e sottogruppi. Quando è stata scoperta un’interazione significativa, è stata eseguita una semplice analisi degli effetti principali. P  <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Disponibilità dei dati

I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su ragionevole richiesta.

gli ionizzatori d’acqua AlkaViva H2
tutti i generatori di acqua a idrogeno

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Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da Coway Co., Ltd. e dalla National Research Foundation of Korea (NRF-2018R1D1A1B07048023).

Informazioni sull’autore

Affiliazioni

Contributi

Le responsabilità degli autori erano le seguenti: D.-MS e EYC: progettavano la ricerca; MS e C.-SK: hanno condotto la ricerca; MS, W.-JS e Y.-KL: dati raccolti e analizzati; MS: ha preparato il manoscritto; D.-MS: rivisto e modificato il manoscritto.

autore corrispondente

Corrispondenza a Dong-Mi Shin .

Dichiarazioni etiche

Interessi conflittuali

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

Informazioni aggiuntive

Nota dell’editore

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Sim, M., Kim, CS., Shon, WJ. et al. L’acqua ricca di idrogeno riduce le risposte infiammatorie e previene l’apoptosi delle cellule del sangue periferico negli adulti sani: uno studio randomizzato, in doppio cieco e controllato. Sci Rep 10, 12130 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-68930-2

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