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Effetti dell’idrogeno molecolare valutati da un modello animale e uno studio clinico randomizzato su lieve alterazione cognitiva

Effetti dell’idrogeno molecolare valutati da un modello animale e uno studio clinico randomizzato su lieve alterazione cognitiva

Kiyomi Nishimaki , 1 Takashi Asada , 2, 3, * Ikuroh Ohsawa , 1, 4 Etsuko Nakajima , 2 Chiaki Ikejima , 2Takashi Yokota , 1 Naomi Kamimura , 1 e Shigeo Ohta 1, 5, *

Dati associati

Materiali supplementari

Astratto

Sfondo:

Lo stress ossidativo è uno dei fattori causali nella patogenesi delle malattie neurodegenerative tra cui lieve compromissione cognitiva (MCI) e demenza. Abbiamo precedentemente riferito che l’idrogeno molecolare (H2) agisce come antiossidante terapeutico e preventivo.

Obbiettivo:

Valutiamo gli effetti del bere acqua con idrogeno molecolare H2 (acqua infusa con idrogeno molecolare  H2) su topi modello di stress ossidativo e soggetti con MCI.

metodi:

Topi transgenici che esprimono una forma dominante negativa di aldeide deidrogenasi 2 sono stati usati come modello di demenza. Ai topi con maggiore stress ossidativo è stato permesso di bere acqua con idrogeno molecolare  H2. Per uno studio clinico controllato in doppio cieco a controllo randomizzato controllato verso placebo, 73 soggetti con MCI hanno bevuto ~ 300 mL di acqua con idrogeno molecolare H2 (gruppo H2) o acqua placebo (gruppo di controllo) al giorno e la sottoscala cognitiva della scala di valutazione della malattia di Alzheimer I punteggi (ADAS-cog) sono stati determinati dopo 1 anno.

risultati:

Nei topi, bere acqua con idrogeno molecolare H2 diminuiva i marker di stress ossidativo e sopprimeva il declino della compromissione della memoria e della neurodegenerazione. Inoltre, la durata media della vita nel gruppo acqua con idrogeno molecolare-H2 era più lunga di quella del gruppo di controllo. Nei soggetti con MCI, sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa tra i gruppi acqua con idrogeno molecolare H2 e di controllo nel punteggio dei pignoni ADAS dopo 1 anno, i portatori del tipo geno di apolipoproteina E4 (APOE4) nel gruppo acqua con idrogeno molecolare H2 sono stati migliorati significativamente sul pignone ADAS totale punteggio del task di richiamo delle parole e dei punteggi (uno dei punteggi secondari del punteggio del dente ADAS).

Conclusione:

L’acqua con idrogeno molecolare H2 può avere un potenziale per sopprimere la demenza in un modello di stress ossidativo e nei portatori APOE4 con MCI.

1. INTRODUZIONE

Lo stress ossidativo è uno dei fattori causali nella patogenesi delle principali malattie neurodegenerative tra cui il morbo di Alzheimer (AD), lieve deficit cognitivo (MCI) e morbo di Parkinson (PD) [ 1 , 2 ]. Inoltre, il genotipo dell’apolipoproteina E4 (APOE4) è un rischio genetico per l’AD e l’aumento dello stress ossidativo nei portatori di APOE4 è considerato uno dei modificatori del rischio [ 3 ].

Per esplorare efficaci antiossidanti alimentari per mitigare la neurodegenerazione dipendente dall’età, può essere utile costruire topi modello in cui i fenotipi AD progrediscano in modo dipendente dall’età in risposta allo stress ossidativo. Abbiamo costruito topi DAL101 transgenici che esprimono un polimorfismo del gene mitocondriale dell’aldeide deidrogenasi 2 (ALDH2 * 2) [ 4 ]. ALDH2 * 2 è responsabile di una carenza nell’attività di ALDH2 ed è specifica per gli asiatici nord-orientali [ 5 ]. Abbiamo riferito in precedenza che la carenza di ALDH2 è un fattore di rischio per AD ad esordio tardivo nella popolazione giapponese, [ 6 ] che è stato riprodotto da studi cinesi e coreani nelle rispettive popolazioni [ 7 , 8 ]. Topi DAL101 hanno mostrato una ridotta capacità di disintossicare 4-idrossi-2-nonenale (4-HNE) nei neuroni corticali, e di conseguenza una neurodegenerazione dipendente dall’età, declino cognitivo e una durata della vita ridotta [ 4 ].

Abbiamo proposto che l’idrogeno molecolare (H 2 ) abbia un potenziale come nuovo antiossidante, [ 9 ] e numerosi studi hanno fortemente suggerito il suo potenziale per applicazioni preventive e terapeutiche [ 10– 12 ]. Oltre a numerosi esperimenti su animali, sono stati riportati più di 25 studi clinici che esaminano l’efficacia di idrogeno molecolare H 2 , [ 11 , 12 ] inclusi studi clinici in doppio cieco. Sulla base di questi studi, il campo della medicina dell’idrogeno sta crescendo rapidamente.

Esistono diversi metodi per somministrare idrogeno molecolare H 2 , incluso l’inalazione di idrogeno gassoso (H 2- gas), il consumo di acqua disciolta in idrogeno molecolare H 2 (acqua con idrogeno molecolare H 2 ) e l’iniezione di soluzione salina disciolta in H 2 (soluzione salina ricca di idrogeno) [ 13 ]. Bere acqua con idrogeno molecolare H 2 ha prevenuto i disturbi cronici indotti dallo stress nell’apprendimento e nella memoria riducendo lo stress ossidativo nei topi [ 14 ] e protegge le cellule neurali stimolando l’espressione ormonale della grelina [ 15 ]. Inoltre, l’iniezione di soluzione salina ricca di idrogeno ha migliorato la funzione di memoria in un modello di ratto di demenza indotta da beta-amiloide riducendo lo stress ossidativo [ 16 ]. Inoltre, l’inalazione di idrogeno durante la rianimazione normossica ha migliorato l’esito neurologico in un modello di ratto di arresto cardiaco indipendentemente dalla gestione della temperatura mirata [ 17 ].

In questo studio, abbiamo esaminato se bere acqua con idrogeno molecolare H 2 potesse sopprimere il deterioramento della memoria dipendente dall’invecchiamento indotto dallo stress ossidativo nei topi DAL101. Successivamente, in uno studio randomizzato in doppio cieco controllato con placebo, abbiamo studiato se l’acqua con idrogeno molecolare H 2 potesse ritardare la progressione dell’MCI, come valutato dai punteggi sulla scala secondaria cognizione della scala di valutazione della malattia di Alzheimer (dente ADAS) [ 18 , 19 ] dal basale a 1 anno. Abbiamo riscontrato un miglioramento significativo della cognizione a 1 anno nei portatori con il genotipo APOE4 nel gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 utilizzando punteggi sub-e totali ADAS-cog.

2. MATERIALI E METODI

2.1. Approvazione etica e consenso alla partecipazione

Questo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato per la cura e l’uso degli animali della Nippon Medical School. I metodi sono stati eseguiti in “conformità” con le linee guida e i regolamenti pertinenti.

Il protocollo dello studio clinico è stato approvato dai comitati etici dell’Università di Tsukuba e registrato nella rete di informazione medica dell’ospedale universitario (UMIN) come UMIN000002218 il 17 luglio 2009 all’indirizzo https://upload.umin.ac.jp/cgi-open -bin / ctr / ctr.cgi? function = history & action = list & type = summary & recptno = R000002-725 & language = J.

I partecipanti sono stati arruolati a partire da luglio 2009. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto prima delle indagini di ricerca, che sono state condotte secondo la Dichiarazione di Helsinki e le successive revisioni.

2.2. Topi DAL101 transgenici

Topi transgenici (DAL101) che esprimono un transgene contenente una versione murina di ALDH2 * 2 sono stati costruiti come precedentemente descritto [ 4 ]. Poiché il numero di topi utilizzati per ciascun esperimento non era coerente a causa di una difficoltà di riproduzione, è stato specificato il numero di topi utilizzati. Tutti i topi sono stati tenuti in un ciclo luce / buio di 12 ore con accesso ad libitum al cibo e all’acqua. Gli esaminatori hanno eseguito esperimenti in modo cieco. Poiché non è stato osservato alcun declino significativo nel deterioramento cognitivo all’età di 18 mesi nei topi selvatici con lo stesso background genetico (C57BL / 6), [ 4 ] gli effetti dell’acqua acqua con idrogeno molecolare H 2 non sono stati valutati in questo studio.

2.3. Idrogeno

Per esperimenti su animali, è stata preparata acqua satura di H 2 come precedentemente descritto [ 14 ]. In breve, l’H 2 è stato sciolto in acqua ad alta pressione (0,4 MPa) a un livello sovrasaturato e l’acqua saturata H 2 è stata immagazzinata sotto pressione atmosferica in un sacchetto di alluminio senza spazio di testa.Come controllo, l’acqua con idrogeno molecolare H 2 è stata completamente degassata agitando delicatamente per un giorno. Ai topi è stata data acqua liberamente usando recipienti di vetro chiusi dotati di una linea di uscita contenente due cuscinetti a sfera, che impedivano il degasaggio dell’acqua. La nave è stata riempita di fresco con acqua con idrogeno molecolare H 2 6 giorni alla settimana alle 14:00. La concentrazione di H 2 era ancora superiore a 0,3 mM il giorno successivo.

Per questo studio clinico, l’acqua con idrogeno molecolare H 2 disponibile in commercio è stata un regalo di Blue Mercury, Inc. (Tokyo, Giappone). L’acqua con idrogeno molecolare H 2 (500 mL) è stata confezionata in un sacchetto di alluminio senza spazio di testa per mantenere la concentrazione di H 2 e sterilizzata a 80 ° C per 30 minuti. La concentrazione di H 2 è stata misurata utilizzando un sensore di idrogeno (Unisense, Aarhus N, Danimarca) e utilizzata se il valore era superiore a 0,6 mM. Blue Mercury Inc. ha fornito anche acqua per placebo confezionata in un pacchetto identico (500 ml). Questa società non ha svolto alcun ruolo nella raccolta dei dati, nella gestione, nell’analisi o nell’interpretazione dei dati. È stato fornito un pacchetto con 500 mL di placebo o acqua con idrogeno molecolare H 2al giorno dopo aver mostrato i precedenti pacchetti vuoti, in base ai quali i tassi di conformità auto-segnalati nel gruppo di intervento sono stati calcolati come volume di acqua con idrogeno molecolare H 2 a 1 anno.

2.4. Misurazione dello stress ossidativo

Come marcatore dello stress ossidativo, 8-OHdG [ 20 ] è stato misurato usando campioni di urina, che sono stati raccolti tra le 9:00 e le 10:00 come descritto in precedenza [ 21 ], utilizzando un test immunologico competitivo collegato agli enzimi (Nuovo 8-OHdG check; Japan Institute for the Control of Aging, Shizuoka, Giappone). I valori sono stati normalizzati dalla concentrazione di creatinina urinaria, che è stata analizzata utilizzando un kit standard (Wako, Kyoto, Giappone). Come ulteriore marker di stress ossidativo nel cervello, la MDA accumulata è stata determinata utilizzando un kit di analisi Bioxytech MDA-586 (Percipio Biosciences, CA, USA). I livelli di malondialdeide (MDA) sono stati normalizzati rispetto alle concentrazioni proteiche.

2.5. Misurazione del deterioramento della memoria: attività di riconoscimento degli oggetti

Le capacità di apprendimento e di memoria sono state esaminate usando il task di riconoscimento delle obiezioni (ORT) [ 4 ]. Un topo è stato abituato in una gabbia per 4 ore, quindi due oggetti di forma diversa sono stati presentati al topo per 10 minuti come allenamento. Il numero di volte di esplorazione e / o annusamento di ciascun oggetto è stato conteggiato per i primi 5 minuti (test di allenamento). Le frequenze (%) nel test di allenamento sono state considerate come sfondi. Per testare la conservazione della memoria dopo 1 giorno, uno degli oggetti originali è stato sostituito con uno nuovo di forma diversa e quindi i tempi di esplorazione e / o annusamento sono stati conteggiati per i primi 5 minuti (test di conservazione).Quando i topi perderebbero le capacità di apprendimento e di memoria, le frequenze di esplorazione e / o annusamento di ciascun oggetto dovrebbero essere uguali (circa il 50%) durante la sessione di addestramento, indicando che i topi hanno mostrato un interesse simile in ciascun oggetto a causa della mancanza di memoria per il oggetti. Le capacità di apprendimento e di memoria sono state valutate come sottrazione delle frequenze (%) nel test di conservazione da ciascun background (test di allenamento).

2.6. Misurazione del deterioramento della memoria: attività di prevenzione passiva (PA)

L’apparato consisteva di due scomparti, uno chiaro e l’altro scuro, separati da una porta scorrevole verticale [ 22 ]. Il primo giorno, inizialmente abbiamo posizionato un mouse nello scomparto della luce per 20 secondi. Dopo l’apertura della porta, il topo poteva entrare nel compartimento buio (i topi preferiscono istintivamente essere al buio). Il giorno 2, il mouse è stato nuovamente posizionato nella sezione chiara per consentire al mouse di spostarsi nella sezione scura. Dopo che il mouse entrò nel compartimento buio, la porta fu chiusa. Dopo 20 secondi, il mouse ha ricevuto una scarica elettrica di 0,3 mA per 2 secondi. Il mouse è stato autorizzato a recuperare per 10 secondi, quindi è stato riportato nella gabbia di casa. Il giorno 3, 24 ore dopo lo shock, il mouse è stato nuovamente posizionato nella sezione chiara con la porta aperta per consentire al mouse di spostarsi nella sezione scura. Abbiamo esaminato il tempo di latenza per varcare la soglia. Le capacità di apprendimento e di memoria sono state valutate come la sottrazione dei tempi di latenza dopo la scossa elettrica da ciascun background (prima).

2.7. Immunocolorazione della regione dell’ippocampo CA1

Per esaminare la perdita neuronale e l’attivazione gliale, la regione dell’ippocampo è stata colorata con un anticorpo anti-NeuN piramidale specifico per il neurone (clone A60; Merck Millipore, Darmstadt, Germania), una proteina acida fibrillare anti-gliale specifica per astrociti (anti-GFAP) anticorpo (Thermo Scientific, MA, USA) o un anticorpo anti-IbaI specifico per la microglia (Wako). I topi sono stati transcardialmente perfusi per essere fissati con paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in anestesia, e il loro cervello è stato crioprotetto con saccarosio al 30%, e quindi il cervello congelato è stato sezionato a 8 μm di spessore. Dopo l’incubazione con ciascun anticorpo primario, le sezioni sono state trattate con anticorpi secondari (Vector Laboratories, CA, USA) e la loro immunereattività è stata visualizzata con il metodo complesso avidina-biotina (Vector Laboratories).

2.8. Soggetti dello studio clinico

Questo studio è stato uno studio randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo condotto nell’ambito del progetto Tone, uno studio epidemiologico in corso condotto a Tone Town, Ibaraki, in Giappone, come descritto in dettaglio in precedenza [ 23 , 24 ]. Questa città si trova a circa 40 km a nord-est del centro di Tokyo ed è composta da 22 distretti. L’indagine di base del progetto Tone ha incluso 1.032 partecipanti a luglio 2009 e soggetti del presente studio sono stati reclutati da questi partecipanti.

I criteri di ammissibilità sono di età pari o superiore a 67 anni, in grado di fornire un consenso informato scritto per la partecipazione al presente studio, con una diagnosi di MCI, in grado di osservare i seguenti requisiti: buona conformità con il consumo di acqua; partecipazione agli esami previsti per la valutazione;tenere un diario di bordo che registra il consumo di acqua, con un punteggio ischemico di Hachinski modificato di 4 o meno e un punteggio della scala di depressione geriatrica di 15 elementi di 6 o meno. In breve, 3 mesi prima di questo studio clinico, tutti i partecipanti sono stati sottoposti a una valutazione di gruppo che ha utilizzato una serie di 5 test che hanno misurato i seguenti domini cognitivi: attenzione;memoria; funzione visuospaziale; linguaggio; e ragionamento come precedentemente descritto [ 25 ].Compromissione obiettiva in almeno 1 dominio cognitivo in base alla media dei punteggi sulle misure neuropsicologiche all’interno di quel dominio e 1 cut-off della DS mediante correzioni normative per età, anni di istruzione e sesso.

I criteri di esclusione avevano criteri “Manuale diagnostico e statistico dei disturbi mentali (DSM) -IV TR” per le malattie da demenza, malattie gravi o instabili, una storia negli ultimi 5 anni di gravi malattie infettive che colpiscono il cervello e / o malattie maligne , una storia di abuso o dipendenza da alcol o droghe (su DSM-IV TR) negli ultimi 5 anni e che ha ricevuto qualsiasi tipo di farmaco anti-Alzheimer e la recente (entro 4 settimane) iniziazione di farmaci che colpiscono il sistema nervoso centrale. Quando il punteggio del Mini Mental State Examination (MMSE) [ 26 ] era inferiore a 24, i soggetti erano esclusi.

In questo studio, i soggetti sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di intervento, che ha ricevuto acqua con idrogeno molecolare H 2 ogni giorno per 1 anno, oppure a un gruppo di controllo, che ha ricevuto acqua placebo. La sequenza di allocazione è stata determinata da numeri casuali generati dal computer che sono stati nascosti agli investigatori e ai soggetti. Drs. Nakajima e Ikejima hanno generato la sequenza di allocazione casuale, iscritti iscritti e assegnato partecipanti agli interventi. Tutti i partecipanti e gli operatori sanitari sono stati mascherati alla cieca.

Nel protocollo originale, abbiamo pianificato di somministrare acqua con idrogeno molecolare H 2 per 2 anni e valutare gli esiti secondari; tuttavia, nel 2011 abbiamo dovuto interrompere il progetto a causa del disastro dello Tsunami e non siamo riusciti a ottenere i dati di 2 anni e gli esiti secondari.

Il genotipo APOE4 è stato determinato come descritto [ 25 ].

2.9. Considerazioni statistiche

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite da un biostatista accademico utilizzando il software SAS versione 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). I risultati sono stati considerati significativi in p <0,05.

Per il confronto di due gruppi nelle capacità di apprendimento e di memoria e durata della vita, il test t di Student a due code non accoppiato è stato utilizzato per il confronto del gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 con il gruppo di controllo. Per gli altri esperimenti sugli animali, è stata applicata l’analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con l’analisi post hoc di Tukey-Kramer o Dunnett, salvo diversa indicazione.

Per la sperimentazione clinica, abbiamo pianificato di reclutare un totale di 120 pazienti, che avrebbero fornito il 90% di potenza per rilevare una dimensione dell’effetto di 0,6 utilizzando un test a due lati con un livello di significatività del 5%, ma la dimensione del campione effettiva per l’analisi primaria era 73, portando al 70% di potenza nella stessa impostazione. Gli end-point erano punteggi nella versione giapponese del pignone ADAS a 1 anno e le modifiche sono state valutate dal test U di Mann-Whitney (analisi non parametrica) e dal test t di Student (analisi parametrica).

3. RISULTATI

3.1. Stress ossidativo ridotto all’idrogeno-acqua nei topi DAL

Ai topi DAL101 maschi sono stati somministrati H 2 – o controllo dell’acqua da bere ad libitum dall’età di 1 mese e sono proseguiti fino all’età di 18 mesi. Il gruppo DAL101 di acqua con idrogeno molecolare H 2 ha mostrato una riduzione significativa del livello di un marcatore di stress ossidativo, 8-idrossi-2′-desossiguanosina urinaria (8-OHdG) [ 20 ] all’età di 14 mesi (Suppl. Fig. S1A ). Inoltre, i topi DAL101 hanno aumentato lo stress ossidativo nel cervello, misurato dal livello di MDA come marker di stress ossidativo alternativo, e l’acqua con idrogeno molecolare H 2 ha mostrato un recupero significativo di questo aumento del livello di MDA nei topi DAL101 (Suppl. Fig. S1B ).

3.2. L’acqua di idrogeno ha represso il declino dell’apprendimento e della memoria

Abbiamo esaminato le capacità di apprendimento e di memoria usando ORT [ 4 ]. Come descritto in MATERIALI E METODI , le capacità di apprendimento e di memoria sono state valutate come sottrazione della frequenza (%) nel test di ritenzione da ciascun background (test di allenamento). Ai topi è stato fornito controllo o acqua con idrogeno molecolare H 2 dall’età di 1 mese. All’età di 14 mesi, il gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 memorizzava in modo significativo gli oggetti originali e mostrava la preferenza per il nuovo oggetto rispetto al gruppo di controllo (Fig. 1A 1A di 14 mesi ).

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L’acqua di idrogeno ha impedito il declino cognitivo. L’acqua con idrogeno molecolare H 2 è stata fornita dall’età di 1 mese ( A, C ) e dall’età di 8 mesi ( B ). I topi sono stati sottoposti al primo compito di riconoscimento delle obiezioni (ORT) all’età di 14 mesi ( A, B, 14 mesi ) e il secondo ORT all’età di 18 mesi ( A, B, 18 mesi ). Gli indici di riconoscimento sono stati ottenuti come la frequenza (%) di esplorare e / o annusare l’oggetto che sarebbe stato sostituito o quello nuovo che era stato sostituito. Δ L’indice di riconoscimento (%) indica le frequenze nel test di ritenzione di ORT dopo la sottrazione di quelle nel test di allenamento (sfondo). WT, wild-type; (DAL, H 2-), topi DAL101 che bevono acqua di controllo degassata; (DAL, H 2 +), topi DAL101 che bevono acqua a idrogeno. I dati sono mostrati come media ± SEM. n = 9, * p <0,05, ** p <0,01 dal test t di Student. C ) I topi sono stati sottoposti a un compito di evitamento passivo. Si ottengono latenze step-through prima e dopo la scossa elettrica e le latenze Δ Step-through indicano la sottrazione delle latenze step-through dopo prima della scossa elettrica. WT, wild-type (n = 10); Topi DAL, H 2 -, DAL101 che ricevono acqua di controllo degassata (n = 8); e topi DAL, H 2 +, DAL101 che ricevono acqua idrogenata / acqua H 2 (n = 8). I dati sono mostrati come media ± SEM. p <0,05.

All’età di 18 mesi, i topi sono stati sottoposti al secondo ORT, che può essere fatto utilizzando oggetti diversi all’età di 18 mesi [ 14 ]. I topi DAL101 anziani che bevevano acqua con idrogeno molecolare H 2 memorizzavano ancora in modo significativo gli oggetti originali e preferivano il romanzo in più rispetto al gruppo di controllo (Fig. 1A 1A di 18 mesi ).

Successivamente, per testare gli effetti del bere dell’acqua con idrogeno molecolare H 2 dalla fase successiva, abbiamo iniziato a somministrare acqua con idrogeno molecolare H 2 a topi DAL101 maschi all’età di 8 mesi anziché 1 mese e sottoposti a ORT all’età di 14 mesi ( Fig. 1B 1B di 14 mesi ) e il secondo ORT all’età di 18 mesi (Fig. 1B 1B di 18 mesi ). Anche quando i topi hanno iniziato a bere all’età di 8 mesi, l’acqua con idrogeno molecolare H 2 ha significativamente soppresso il declino delle capacità di apprendimento e di memoria all’età di 18 mesi e all’età di 14 mesi (Fig. 1B 1B ) .

Inoltre, abbiamo sottoposto i topi alla PA [ 22 ] all’età di 18 mesi come metodo alternativo. Un giorno dopo una scarica elettrica di 0,3 mA per 2 secondi, i topi C57BL / 6 wild-type hanno memorizzato la scarica, valutata dalla sottrazione dei tempi di latenza per rientrare nel compartimento buio da ciascuno sfondo (Fig. 1C1C ). Il gruppo H 2- acqua con idrogeno molecolare ha significativamente soppresso il declino dell’apprendimento e della memoria più del gruppo di controllo (Fig. 1C 1C ).

Pertanto, bere acqua con idrogeno molecolare H 2 ha soppresso l’apprendimento e la compromissione della memoria nei topi dello stress ossidativo.

3.3. Neurodegenerazione soppressa dall’idrogeno-acqua

Per esaminare se l’acqua con idrogeno molecolare H 2 potesse prevenire la neurodegenerazione nei topi DAL101 anziani, abbiamo colorato l’ippocampo con un anticorpo anti-NeuN specifico per il neurone (Fig. 2A 2A ). La neurodegenerazione è stata valutata mediante attivazioni gliali utilizzando un anticorpo anti-GFAP e un anticorpo anti-Iba-I specifico della microglia. Cellule immuno-positive per campo visivo (FOV) sono state contate nella regione CA1 (Fig. 2B 2B ).

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Neurodegenerazione repressa acqua a idrogeno. A ) La regione dell’ippocampo CA1 è stata colorata con anticorpi contro NeuN (un marcatore neuronale), GFAP (un marcatore astrocitico) o Iba-1 (un marcatore microgliale) (barre di scala: 50 µm). I pannelli di destra mostrano immagini ingrandite dei quadrati nei pannelli di sinistra (barre della scala: 10 µm). B ) Le cellule positive per anticorpi anti-NeuN, anti-GFAP e anti-Iba-I per campo visivo (FOV) sono state contate nella regione CA1 (n = 5). I dati sono mostrati come media ± SD. p <0,05, ** p <0,01 (wild-type vs DAL), # p <0,05 (H 2 -water vs. control water in DAL).

Il numero di neuroni è stato ridotto nel gruppo di controllo DAL101 come confronto con il gruppo di tipo selvaggio, e il gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 -DAL101 ha mostrato una tendenza nel recupero della diminuzione (Fig. 2A 2A). Come è stato descritto in precedenza, [ 4 ] i topi DAL101 di controllo hanno mostrato un aumento dell’attivazione gliale, e il gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2- acqua ha soppresso l’attivazione gliale potenziata nella regione CA1 (Fig. 2 2 , GFAP e Iba-I).

3.4. L’acqua idrogenata ha prolungato la durata media della vita dei topi

I topi DAL101 hanno mostrato una durata più breve, che è stata anche descritta in precedenza [ 4 ]. Per esaminare se il consumo di acqua con idrogeno molecolare H 2 ha attenuato la durata della vita ridotta, i topi DAL101 femmine hanno iniziato a bere controllo o acqua con idrogeno molecolare H 2 all’età di 1 mese. Sebbene l’acqua con idrogeno molecolare H 2 non abbia prolungato la durata massima della vita (Fig. 3A 3A ), l’acqua con idrogeno molecolare H 2 ha esteso significativamente la durata media della vita dei topi DAL101 (Fig. 3B 3B ).

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Estensione della vita media bevendo continuamenteacqua idrogenata / acqua H 2 . A ) Curva di Kaplan-Meier che rappresenta la sopravvivenza di topi C57BL / 6 femminili (wild-type), topi DAL101 femmina che bevono acqua di controllo (acqua di controllo) e acqua H 2 (acqua con idrogeno molecolare ). B ) Ogni punto indica la durata di ogni mouse. Le barre indicano la durata media di ciascun gruppo. p < 0,05 (p = 0,036) dal test t di Student.

3.5. Uno studio clinico randomizzato, controllato con placebo

shows the profile on the recruitment, randomization, and follow-up of this study. La Fig. (4 4 ) mostra il profilo sul reclutamento, randomizzazione e follow-up di questo studio. Un totale di 81 soggetti dei 1.032 partecipanti sono stati randomizzati; tuttavia, 3 nel gruppo di controllo e 5 nel gruppo di intervento sono stati diagnosticati non ammissibili dopo la randomizzazione e non inclusi in questa analisi. Caratteristiche di base e fattori dello stile di vita erano bilanciati tra i gruppi di studio (Tabella 1 1 ). L’assegnazione casuale è stata stratificata per età di ~ 74 anni e punteggio MMSE di ~ 28 punti. Il tasso medio di conformità dell’acqua potabile è stato stimato pari al 64% in entrambi i gruppi a 1 anno, il che significa che i soggetti hanno bevuto in media 320 ml / giorno. Il punteggio medio medio di ADAS-cog in H 2 – e gruppi di controllo erano 8.04 e 7.89, rispettivamente, senza significato.

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Profilo del reclutamento, randomizzazione e follow-up di questo studio. Questo studio era uno studio randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo, condotto nell’ambito del progetto Tone, uno studio epidemiologico in corso condotto a Tone Town, Ibaraki, Giappone [ 23 , 24 ].

Tabella 1

Caratteristiche di fondo di 73 soggetti con lieve deficit cognitivo.

Controllo (n = 38) Intervento (n = 35)
Significare SD o% Significare SD o%
Donna * 20 (52,6%) 19 (54,3%)
Età (anni) 74.45 5.44 73.97 5.11
Indice di massa corporea (kg / m 2 ) 23.55 2.59 23.19 4.08
Pressione arteriosa sistolica (mmHg) 131.26 12.35 135.14 13.31
Pressione sanguigna diastolica (mmHg) 77.92 7.13 78.89 9.53
Istruzione (anni) 11.26 2.71 11.57 2.83
Bevitore attuale di alcolici * 19 (50,0%) 14 (40,0%)
Fumatore attuale * 4 (10,5%) 5 (14,3%)
Attuale esercizio fisico * 27 (71,1%) 22 (62,9%)
Trasportatore APOE4 * 6 (15,7%) 7 (20,0%)
Storia famigliare * 2 (5,3%) 2 (5,7%)
Comorbidità *
Ipertensione 15 (39,5%) 14 (40,0%)
Diabete mellito 4 (10,5%) 5 (14,3%)
dislipidemia 4 (10,5%) 4 (11,4%)
Ictus 2 (5,3%) 1 (2,9%)
Depressione 1 (2,6%) 2 (5,7%)
MMSE 28.08 1,66 27.83 1.74
ADAS-Cog 7.89 3.19 8.04 3.47

* indica la frequenza (%).

Dopo 1 anno, non sono stati riscontrati danni osservabili o effetti indesiderati in ciascun gruppo e si è osservata una tendenza a migliorare il punteggio totale dei pignoni ADA sia nei gruppi acqua con idrogeno molecolare H 2 che nei gruppi di controllo (Suppl. Tabella S1 ), probabilmente a causa di interventi del genere come esercizio moderato da parte del progetto Tone. Inoltre, i soggetti nel gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 avevano più tendenze per il miglioramento rispetto a quelli nei gruppi di controllo sebbene non vi fosse alcun significato (Suppl. Tabella S1 ).Tuttavia, quando prestiamo attenzione alle variazioni del punteggio nei portatori del genotipo APOE4, i punteggi totali dei pignoni ADAS e dei compiti di richiamo delle parole (uno dei punteggi secondari) sono notevolmente migliorati, come valutato dalla distribuzione della variazione del punteggio in ogni materia ( Fig. 5 5 ). Nei vettori APOE4, il gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 è notevolmente migliorato, mentre il gruppo di controllo è leggermente peggiorato. shows the score change of each subject as an alternative presentation.Inoltre, la Fig. (6 6 ) mostra la variazione del punteggio di ciascun argomento come presentazione alternativa.Sebbene i soggetti nel gruppo di controllo non siano migliorati, sei e cinque su 7 soggetti sono migliorati rispettivamente nel punteggio totale ADAS e nei punteggi delle attività di richiamo delle parole nel gruppo acqua con idrogeno molecolare H 2 dei portatori APOE4.

Un file esterno che contiene un'immagine, un'illustrazione, ecc. Il nome dell'oggetto è CAR-15-482_F5.jpg

Distribuzione delle variazioni del punteggio di ingranaggio secondario e totale di ADAS. Distribuzione del punteggio del compito di richiamo delle parole ( A ), di un sotto-punteggio di ADAS-cog e ( B ) del punteggio totale di ADAS-cogs in vettori non APOE4 (a sinistra) e APOE4 (a destra). Ogni punto indica il cambio di singoli soggetti. La differenza tra i gruppi acqua con idrogeno molecolare H2 e di controllo era significativa nei portatori APOE4 mediante un’analisi non parametrica e un’analisi parametrica. A ) p = 0,036 (dal test t di Student) e p = 0,047 (dal test U di Mann-Whitney) e ( B ) p = 0,037 (dal test t di Student) e p = 0,044 (dal test U di Mann-Whitney ) per ( A ) e ( B ), rispettivamente. Le barre centrali nelle losanghe indicano i valori mediani.

Un file esterno che contiene un'immagine, un'illustrazione, ecc. Il nome dell'oggetto è CAR-15-482_F6.jpg

Cambiamenti in un punteggio sub-dolorante e totale di ADAS di ciascun soggetto nei vettori APOE4.Ogni riga indica la variazione di 1 anno del punteggio del task di richiamo delle parole ( A ) e del punteggio totale del dente ADAS ( B ) di un soggetto nei vettori APOE4. * indica p <0,05 come mostrato nella legenda della Fig. 5 .

DISCUSSIONE

Disturbi neurodegenerativi dipendenti dall’età sono coinvolti nello stress ossidativo. In questo studio, abbiamo dimostrato che bere

L’acqua con idrogeno molecolare H 2 ha soppresso il declino biochimico, comportamentale e patologico nei topi da stress ossidativo.Il punteggio di ADAS-cog [ 18 ] è la misura cognitiva generale più utilizzata negli studi clinici di AD [ 27 , 28 ]. Il punteggio ADAS-cog valuta più domini cognitivi tra cui memoria, lingua, prassi e orientamento.Nel complesso, il pignone ADAS si è dimostrato efficace per lo scopo previsto. Il presente studio clinico mostra che bere acqua con idrogeno molecolare H 2 ha migliorato in modo significativo il punteggio del dente ADAS dei portatori di genotipo APOE4.

Abbiamo precedentemente dimostrato che i topi DAL101 mostrano neurodegenerazione dipendente dall’età, declino cognitivo e riduzione della durata della vita [ 4 ]. I topi DAL101 mostrano fenotipi di demenza in modo dipendente dall’età in risposta a una crescente quantità di stress ossidativo [ 4 ]. Lo stress ossidativo migliora la perossidazione lipidica, portando alla formazione di aldeidi altamente reattive α, β-insature, come MDA e 4-HNE [ 29 ]. L’accumulo di proteine ​​addotte da 4-HNE nei neuroni piramidali è stato osservato nel cervello di pazienti con AD e PD [ 30 ]. Il declino della capacità di ALDH2 * 2 non è riuscito a disintossicare le aldeidi citotossiche e di conseguenza aumenta lo stress ossidativo [ 31 ].

Inoltre, topi a doppia transgenia sono stati costruiti incrociando topi DAL101 con topi Tg2576, che esprimono una forma mutante di proteina precursore dell’amiloide umana (APP). Hanno mostrato una deposizione accelerata di amiloide, fosforilazione di tau e gliosi, nonché capacità di apprendimento e memoria compromesse. La durata della vita dei topi APP / DAL è stata significativamente più breve di quella dei topi APP e DAL101 [ 32 ]. Pertanto, questi animali modello possono essere utili per esplorare antiossidanti che potrebbero essere in grado di prevenire la demenza dipendente dall’età. In effetti, una dieta contenente clorella ha mostrato effetti mitigati sul declino cognitivo nel DAL101 [ 33 ].

Uno dei più potenti fattori di rischio per l’AD è lo stato di portatore del genotipo APOE4 e i ruoli di APOE4 sulla progressione dell’AD sono stati ampiamente esaminati da vari aspetti [ 34 , 35 ]. L’APOE4 aumenta anche il numero di lipoproteine ​​aterogeniche e accelera l’aterogenesi [ 36 ]. L’aumento dello stress ossidativo nei portatori di APOE4 è considerato uno dei modificatori del rischio [ 3 ]. Una combinazione di antiossidanti ha migliorato la funzione cognitiva dei soggetti anziani dopo 3 anni, specialmente nei portatori di APOE4 [ 23 ]. Questo risultato clinico precedente concorda con il presente studio. L’H 2 agisce come efficace antiossidante all’interno delle cellule grazie alla sua capacità di diffondersi rapidamente attraverso le membrane [ 9 ]. Inoltre, come funzione antiossidativa secondaria, H 2 sembra attivare il fattore 2 (Nrf2) correlato a NF-E2, [ 10 ] che riduce lo stress ossidativo esprimendo una varietà di enzimi antiossidanti [ 37 ]. Abbiamo riferito che bere acqua idrogenata / acqua H 2 ha prevenuto l’arteriosclerosi usando topi knockout APOE, un modello dello sviluppo spontaneo dell’aterosclerosi che accompagnava una diminuzione dello stress ossidativo [ 38 ]. Pertanto, è possibile che bere acqua con idrogeno molecolare H 2 migliori il danno vascolare diminuendo lo stress ossidativo come antiossidante diretto o indiretto, portando al miglioramento di un modello demintia e soggetti MCI. In questo studio, ci siamo concentrati sul genotipo delle isoforme APOE; tuttavia, il polimorfismo del gene APOE nella regione del promotore influenza l’espressione del gene APOE [ 39 ].Pertanto, sarà importante esaminare l’effetto dell’acqua con idrogeno molecolare H 2 sotto questo polimorfismo.

Per mitigare l’AD, è stata prestata particolare attenzione all’esercizio fisico regolare e moderato per aiutare a ridurre il rischio di demenza e prevenire lo sviluppo di MCI nei pazienti anziani [ 40 – 42 ]. L’esercizio fisico moderato migliora il metabolismo energetico e sopprime l’espressione delle citochine pro-infiammatorie [ 43 ] e protegge i sistemi vascolari [ 40 , 44 , 45 ]. L’H 2 presenta molteplici funzioni mediante una diminuzione dei livelli di citochine pro-infiammatorie e un aumento del metabolismo energetico oltre ai ruoli antiossidanti. Per esercitare molteplici funzioni, H 2 regola varie vie di trasduzione del segnale e l’espressione di molti geni [ 10 ]. Ad esempio, l’H 2 protegge le cellule neurali e stimola il metabolismo energetico stimolando rispettivamente l’espressione ormonale della grelina [ 15 ] e del fattore di crescita dei fibroblasti 21, [ 21 ]. Al contrario, l’H 2 allevia l’infiammazione diminuendo le citochine pro-infiammatorie [ 46 ]. Pertanto, la combinazione di queste funzioni di H 2 sull’antinfiammazione e sulla stimolazione del metabolismo energetico potrebbe impedire il declino della funzione cerebrale [ 10 ], entrambi migliorati da un esercizio regolare e moderato. Pertanto, è possibile che le funzioni multipe di H 2, tra cui la stimolazione del metabolismo energetico e l’anti-infiammazione, possano contribuire al miglioramento del modello di demenza e dei soggetti MCI.

Come aspetto alternativo, H 2 sopprime il fattore nucleare della via di trascrizione delle cellule T attivate (NFAT) per regolare vari schemi di espressione genica [ 47 ]. La segnalazione NFAT è alterata nell’AD e svolge un ruolo importante nel guidare la neurodegenerazione mediata da beta-amiloide [ 48 ]. Inoltre, la cascata trascrizionale NFAT contribuisce alla sinaptotossicità β dell’amiloide [ 49 ]. Inoltre, un coinvolgimento attivo della via di segnalazione mediata da NFAT nella degenerazione dei neuroni mediata da alfa-syn [ 50 ]. In effetti, i pazienti con PD sono migliorati bevendo acqua idrogenata /  acqua H 2, come rivelato da uno studio clinico in doppio cieco, controllato con placebo, [ 51 ] e una scala più ampia di uno studio clinico è sotto inchiesta [ 52 ]. Pertanto, gli effetti benefici di H 2 sulle malattie neurodegenerative possono essere spiegati dalla soppressione della regolazione trascrizionale NFAT.

CONCLUSIONE

Il presente studio suggerisce una possibilità per rallentare il progresso della demenza bevendo acqua con idrogeno molecolare  H 2mediante esperimenti su animali e uno studio di intervento clinico per i portatori di APOE4; tuttavia, sarà necessaria una scala più lunga e più ampia di prove per chiarire l’effetto dell’acqua con idrogeno molecolare H 2 sull’MCI.

RINGRAZIAMENTI

Ringraziamo Blue Mercury, Inc. (Tokyo, Giappone) per aver fornito acqua con idrogeno molecolare H 2 e acqua placebo, la signora Hiroe Murakoshi per l’assistenza tecnica e la signora Suga Kato per il lavoro di segreteria. Il sostegno finanziario per questo studio è stato fornito da Grants-in-Aid for Scientific Research della Japan Society for the Promotion of Science (23300257, 24651055 e 26282198 a SO; 23500971 e 25350907 a KN). Il sostegno finanziario per questo studio è stato fornito da Grants-in-Aid for Scientific Research della Japan Society for the Promotion of Science (23300257, 24651055 e 26282198 a SO; 23500971 e 25350907 a KN).

ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

APOE4 Apolipoproteina E4
MCI Lieve deterioramento cognitivo
ALDH2 Aldeide deidrogenasi 2
ADAS-Cog Sottoscala cognitiva della scala di valutazione della malattia di Alzheimer
ANNO DOMINI Il morbo di Alzheimer
PD Morbo di Parkinson
DAL101 Tipo negativo dominante 101 del polimorfismo mutante ALDH2 (ALDH2 * 2)
4-HNE 4-idrossi-2-nonenale
8-OHdG 8-idrossi-2′-deossiguanosina
MDA malondialdeide
ORT Attività di riconoscimento degli oggetti
PAPÀ Compito di evitamento passivo
GFAP Proteina acida fibrillare gliale
PBS Tampone fosfato salino
ANOVA Analisi unidirezionale della varianza
CI Intervallo di confidenza
MMSE Mini esame dello stato mentale
FOV Campo visivo
APP Proteina Precursore Dell’amiloide
Nrf2 Fattore 2 correlato a NF-E2
NFAT Fattore nucleare della cellula T attivata

 

MATERIALE SUPPLEMENTARE

Il materiale supplementare è disponibile sul sito web dell’editore insieme all’articolo pubblicato.

OMOLOGAZIONE ETICA E CONSENSO A PARTECIPARE

Lo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato per la cura e l’uso degli animali della Nippon Medical School.

Il protocollo di studio clinico sull’uomo è stato approvato dai comitati etici dell’Università di Tsukuba.

DIRITTI UMANI E ANIMALI

Tutte le procedure di ricerca sugli animali seguite erano conformi agli standard stabiliti nell’ottava edizione della Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio pubblicata dalla National Academy of Sciences, The National Academies Press, Washington, DC).

Tutto il materiale umano è stato ottenuto in conformità con gli standard stabiliti nella Dichiarazione deiprincipi di Helsinki del 1975, rivista nel 2008 ( http://www.wma.net/en/10ethics/10helsinki/<http://www.wma .net / it / 10ethics / 10helsinki / >).

Consenso alla pubblicazione

Tutti i pazienti hanno fornito priorità di consenso informato scritto alle indagini di ricerca.

CONFLITTO D’INTERESSE

Dichiariamo che non vi è alcun conflitto di interesse effettivo e potenziale in questo studio. Sebbene SO sia stato consulente scientifico di Blue Mercury, Inc. (Tokyo, Giappone) dalle 2.005 alle 2.008, non vi è stato alcun coinvolgimento durante questo studio.

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acqua idrogenata riduce i livelli sierici di colesterolo LDL e migliora la funzione HDL nei pazienti con potenziale sindrome metabolica

L’acqua ricca di idrogeno riduce i livelli sierici di colesterolo LDL e migliora la funzione HDL nei pazienti con potenziale sindrome metabolica.

Song G 1 , Li M , Sang H , Zhang L , Li X , Yao S , Yu Y , Zong C , Xue Y , Qin S.

1Laboratorio chiave di aterosclerosi nelle università di Shandong, Shandong, Cina.

Astratto

Abbiamo scoperto che l’idrogeno (diidrogeno; H2) ha effetti benefici ipolipemizzanti nei criceti dorati siriani ricchi di grassi. L’obiettivo di questo studio era di caratterizzare gli effetti dell’acqua ricca di idrogeno H2 (0,9-1,0 l acqua idrogenata / giorno) sul contenuto, sulla composizione e sulle attività biologiche delle lipoproteine ​​sieriche su 20 pazienti con potenziale sindrome metabolica.

L’analisi del siero ha mostrato che il consumo di acqua ricca di H2/acqua idrogenata per 10 settimane ha determinato una riduzione dei livelli sierici di colesterolo totale (TC) e LDL-colesterolo (LDL-C).

L’analisi Western blot ha rivelato una marcata riduzione dell’apolipoproteina (apo) B100 e dell’apoE nel siero. Inoltre, abbiamo scoperto che acqua idrogenata  H2 ha migliorato significativamente la funzionalità HDL valutata in quattro modi indipendenti, vale a dire,

  1. protezione contro l’ossidazione delle LDL,
  2. inibizione dell’adesione dei monociti indotta dal fattore di necrosi tumorale (TNF) alle cellule endoteliali,
  3. stimolazione del colesterolo efflusso da cellule di schiuma di macrofagi e
  4. protezione delle cellule endoteliali dall’apoptosi indotta da TNF-α.

Inoltre, abbiamo riscontrato che il consumo di acqua ricca di H2 / acqua idrogenata ha comportato un aumento del superossido dismutasi enzimatico antiossidante e una diminuzione delle sostanze reattive all’acido tiobarbiturico in siero intero e LDL. In conclusione, l’integrazione con acqua ricca di H2/acqua idrogenata sembra diminuire i livelli sierici di LDL-C e apoB, migliorare le funzioni HDL danneggiate dalla dislipidemia e ridurre lo stress ossidativo e può avere un ruolo benefico nella prevenzione della potenziale sindrome metabolica.

PMID: 23610159 PMCID: PMC3679390 DOI: 10,1194 / jlr.M036640

acqua idrogenata migliora il metabolismo dei lipidi e del glucosio nei pazienti con diabete di tipo 2 o ridotta tolleranza al glucosio

La supplementazione di acqua idrogenata / ricca di idrogeno migliora il metabolismo dei lipidi e del glucosio nei pazienti con diabete di tipo 2 o ridotta tolleranza al glucosio.

1Kajiyama Clinic, Kyoto 615-0035, Giappone.

Lo stress ossidativo è ampiamente riconosciuto come associato a vari disturbi tra cui diabete, ipertensione e aterosclerosi. È noto che l’idrogeno ha un’azione riducente.

Abbiamo quindi studiato gli effetti dell’assunzione di acqua idrogenata / acqua ricca di idrogeno sul metabolismo dei lipidi e del glucosio nei pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM) o ridotta tolleranza al glucosio (IGT).

Abbiamo condotto uno studio randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo, crossover su 30 pazienti con T2DM controllato dalla dieta e terapia fisica e 6 pazienti con IGT. I pazienti hanno consumato 900 mL / d di acqua pura ricca di idrogeno / acqua idrogenata  o 900 mL di acqua pura placebo per 8 settimane, con un periodo di washout di 12 settimane. Diversi biomarcatori di stress ossidativo, insulino-resistenza e metabolismo del glucosio, valutati con un test di tolleranza al glucosio orale, sono stati valutati al basale e a 8 settimane.

L’assunzione di acqua idrogenata / acqua ricca di idrogeno è stata associata a una significativa riduzione dei livelli di colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL) modificato (ovvero, modifiche che aumentano la carica negativa netta di LDL), LDL a bassa densità e 8-isoprostane urinarie del 15,5% (P <.01), 5,7% (P <.05) e 6,6% (P <.05), rispettivamente.

L’assunzione di acqua idrogenata / acqua ricca di idrogeno è stata anche associata a una tendenza a ridurre le concentrazioni sieriche di LDL ossidato e acidi grassi liberi e ad aumentare i livelli plasmatici di adiponectina e superossido dismutasi extracellulare. In 4 su 6 pazienti con IGT, l’assunzione di acqua idrogenata / acqua ricca di idrogeno ha normalizzato il test di tolleranza al glucosio orale.

 In conclusione, questi risultati suggeriscono che l’integrazione con acqua idrogenata / acqua ricca di idrogeno può avere un ruolo benefico nella prevenzione del T2DM e della resistenza all’insulina.

PMID:  19083400
DOI: 10.1016 / j.nutres.2008.01.008

 2008 marzo; 28 (3): 137-43. doi: 10.1016 / j.nutres.2008.01.008.